ピレノイドのモデリング

Jul 12, 2023

Nature Plants volume 8、pages 583–595 (2022)この記事を引用する

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メトリクスの詳細

多くの真核光合成生物は、ピレノイドと呼ばれる細胞小器官内の CO2 固定酵素 Rubisco に濃 CO2 を供給することで炭素の取り込みを強化します。現在進行中の取り組みでは、このピレノイドベースの CO2 濃縮メカニズム (PCCM) を作物に組み込んで収量を増やすことを目指しています。今回我々は、緑藻クラミドモナス・ラインハルティの仮定されたメカニズムに基づいて、PCCM の計算モデルを開発します。私たちのモデルは、すべてのクラミドモナス PCCM 欠損変異体の表現型を再現し、PCCM の基礎となる一般的な生物物理学的原理を導き出します。我々は、効果的かつエネルギー的に効率的な PCCM には、ピレノイド CO2 漏出を減らす物理的障壁と、CO2 と HCO3- 間の無駄な循環を減らす適切な酵素局在化が必要であることを示します。重要なことに、我々のモデルは、大気レベルの CO2 では純粋に受動的な CO2 取り込み戦略の実現可能性を示していますが、より低い CO2 レベルでは能動的な HCO3- 取り込みが有利であることが証明されています。我々は、CO2 固定あたりわずか 1.3 ATP という理論コストで、植物の葉緑体における CO2 固定速度を最大 3 倍まで高める 4 段階のエンジニアリング経路を提案します。これにより、陸上植物への PCCM エンジニアリングを導くためのフレームワークが提供されます。

CO2 固定酵素 Rubisco は、毎年およそ 1,014 キログラムの炭素が生物圏に流入するのを仲介します 1,2,3。しかし、多くの植物では、ルビスコは大気中の CO2 レベル下で CO2 を最大速度の 3 分の 1 未満に固定しており (補足図 1)4、5、6、これにより米や小麦などの作物の成長が制限されます 7。この制限を克服するために、C4 植物 8,9、ベンケイソウ酸代謝 (CAM) 植物 10、藻類 11,12 およびシアノバクテリア 13 を含む多くの光合成生物は、ルビスコに濃縮 CO2 を供給することによってルビスコの CO2 固定速度を高めています 14,15。藻類では、このような CO2 濃縮メカニズムは、ピレノイドと呼ばれる相分離した細胞小器官内で発生します 16、17、18、19。ピレノイドベースの CO2 濃縮機構 (PCCM) は、地球規模の CO2 固定の約 3 分の 1 を仲介しています16。

これまでの研究により、PCCM の必須分子成分が特定されてきましたが、定量的かつ体系的な分析が不足しているため、このメカニズムの主要な動作原理は依然としてよく理解されていません。。同時に、収量と窒素と水の利用効率を向上させるために、C3 作物に PCCM を組み込むことへの関心が高まっています 30,31。主な質問は次のとおりです: (1) 機能する PCCM を実現するために必要なコンポーネントの最小限のセットは何ですか? (2) 最小限の PCCM を運用する場合のエネルギーコストはいくらですか?

PCCM の理解を進めるために、緑藻類 Chlamydomonas reinhardtii (以下、Chlamydomonas; 図 1a) における仮定されたメカニズムに基づいて反応拡散モデルを開発します 31,32,33: 簡単に言うと、外部無機炭素 (Ci: CO2 および HCO3-) は、トランスポーター LCI1 (Cre03.g162800) および HLA3 (Cre02.g097800) によって細胞膜を通って輸送されます 23、24、34。サイトゾルの Ci は、推定上の間質炭酸脱水酵素 LCIB/LCIC (Cre10.g452800/Cre06.g307500) 複合体 (以下、LCIB) による CO2 から HCO3- への変換を介して、HCO3- の形で葉緑体間質に濃縮されます 22,35。 36、または十分に特徴付けられていない HCO3- トランスポーター LCIA (Cre06.g309000)24,37 による葉緑体膜を通過する直接輸送を介します。 LCIA がパッシブチャネルなのかポンプなのかは現時点では不明です。したがって、モデルでは、最初にそれをパッシブチャネル (LCIAC で示される) として考慮し、その後、アクティブポンプ (LCIAP で示される) として考慮します。間質に入ると、HCO3- は推定上の HCO3- チャネル BST1-3 (Cre16.g662600、Cre16.g663400 および Cre16.g663450)25 を経由してチラコイド内腔に移動し、膜細管を介してピレノイドに拡散し、そこで炭酸脱水酵素 CAH3 ( Cre09.g415700)38、39、40 は HCO3− を CO2 に変換します。この CO2 はチラコイド尿細管内腔からピレノイドマトリックスに拡散し、そこでルビスコが固定を触媒します。補足表 1 は、クラミドモナス PCCM の主要なタンパク質の頭字語をまとめたものです。

a、既知の PCCM コンポーネントを含むクラミドモナスの葉緑体の漫画。 HCO3- は、LCIA によって葉緑体膜を通って輸送され、BST1 ～ 3 によってチラコイド膜を通って輸送されます（簡略化のため、以降 BST と呼びます）。酸性チラコイド内腔では、炭酸脱水酵素 CAH3 が HCO3- を CO2 に変換し、CO2 固定酵素 Rubisco (Rbc) が局在するピレノイドマトリックスに拡散します。マトリックスと葉緑体からの CO2 漏出は、潜在的な拡散障壁 (デンプン鞘とチラコイドのスタック) によって、また CO2 再捕捉複合体 LCIB/LCIC (簡略化のため、以降 LCIB と呼びます) による HCO3- への変換によって妨げられる可能性があります。基本的な葉緑体間質。 b, モデル化された PCCM の概略図。挿入図に示すように、CO2 と HCO3- のコンパートメント内拡散とコンパートメント間交換、およびそれらの相互変換を考慮しています。 aのようなカラーコード。モデルは球対称で、間質に囲まれた中央のピレノイドマトリックスで構成されています。チラコイドは基質と間質を通過します。それらの体積と表面積は、半径方向外側に延びる円柱によって拡張されたマトリックスの中心にある網状ネットワークに対応します。 c、LCIA活性および拡散障壁を欠くベースラインPCCMモデルのチラコイド(破線)およびマトリックス/間質(実線)におけるCO2およびHCO3-の濃度プロファイル。灰色の点線は、CO2 の有効 Rubisco Km を示します (方法)。 aのようなカラーコード。 d, 示された区画間の無機炭素の正味の流量。矢印の幅は光束に比例します。円の面積は、対応する領域の平均分子濃度に比例します。黒い破線のループは、葉緑体中の無機炭素の主な無駄なサイクルを示しています。 aのようなカラーコード。 c および d については、HCO3 に対する LCIAC 媒介葉緑体膜透過性− \(\kappa _{{{{\mathrm{chrom}}}}}^{H^ - }\) = 10−8 m s−1、BST- HCO3 に対する媒介チラコイド膜透過性− \(\kappa _{{{{\mathrm{thy}}}}}^{H^ - }\) = 10−2 m s−1、LCIB 速度 VLCIB = 103 s−1 およびCAH3 レート VCAH3 = 104 s−1 (方法)。他のモデルパラメーターは実験から推定されます (補足表 2)。

球状葉緑体における上記の酵素活性と Ci 輸送をモデル化します。炭酸脱水酵素は CO2 と HCO3- の双方向の相互変換を触媒し、2 つの種が平衡から外れた一方向への正味の流束を生成すると仮定します。一定の pH 値で 3 つの葉緑体コンパートメントを考慮します。中心の球状ピレノイドマトリックス (pH 8、参考文献 41)、周囲の間質 (pH 8、参考文献 41、42)、およびチラコイド (内腔 pH 6、参考文献 43) です。）マトリックスと間質の両方を横断します（図1bおよび補足図2）。コンパートメント内反応と拡散およびコンパートメント間交換のフラックスバランスにより、すべてのコンパートメントにおける Ci 種の定常状態の濃度プロファイルが設定されます (方法)。細胞膜を通過する Ci 輸送の影響を説明するために、葉緑体が Ci を取り込むことができる周囲の広範囲のサイトゾル Ci プールをシミュレートします。モデル化された PCCM のパフォーマンスを 2 つの指標で特徴付けます。(1) ルビスコを通る最大可能流束で正規化された計算された CO2 固定流束によって定量化されるその有効性。 (2) その効率。CO2 固定当たりの ATP コストによって定量化されます (方法)。

機能的なPCCMの最小構成要素を特定するために、炭酸脱水酵素LCIBが間質全体に拡散し、HCO3-のBSTチャネルがチラコイド膜全体に均一に分布し、炭酸脱水酵素CAH3が局在するベースラインモデル（図1c、d）を構築します。ピレノイド内のチラコイド内腔に結合し、ルビスコはピレノイドマトリックス内に凝縮しました。このモデルには、HCO3- トランスポーター LCIA と Ci に対する潜在的な拡散障壁がありません。まず、空気レベル CO2 (10 μM サイトゾル) の下でモデル化された PCCM パフォーマンスを分析します。より低い CO2 条件については、後のセクションで説明します。

葉緑体に拡散する CO2 は、平衡 CO2:HCO3- 比が 1:80 である高 pH 間質で HCO3- に変換されます (方法)。葉緑体エンベロープを横切る HCO3- の受動的拡散は非常に遅いため、この濃縮された HCO3- は間質内に捕捉されます。 BSTチャネルはチラコイド膜全体でHCO3-を平衡させるため、HCO3-もチラコイド内腔内で高濃度に達します（図1c）。チラコイド内腔の低い pH は、CO2 と HCO3- の間のほぼ等しい平衡分配に有利です。しかし、ピレノイドの外側のチラコイドには炭酸脱水酵素 (CA) が存在しないため、HCO3- はピレノイドの外側のチラコイドに入ってもすぐには CO2 と平衡状態になりません。代わりに、HCO3-はチラコイド内腔内でピレノイドに向かって拡散し、そこでピレノイド半径内に局在するCAH3がHCO3-を急速にCO2に変換します（図1d）。この CO2 はチラコイド膜を通ってピレノイドマトリックスに拡散する可能性があります。このベースラインモデルは、コンパートメント間の pH 差のみによって駆動され、PCCM を使用しないモデルで見られるピレノイド CO2 濃度の約 2.5 倍を達成します。

ベースラインモデル（図1d）のマトリックスからのかなりのCO2漏洩は、部分的にはルビスコの比較的遅い反応速度によるものです。 CO2 分子がルビスコによってピレノイド内に固定されるのに必要な平均時間の間に、その CO2 分子は通常、ピレノイドの半径よりも長い距離まで拡散する可能性があります (補足注 I)。したがって、ピレノイドマトリックスに入るCO2分子のほとんどは、ルビスコによって固定されずに去ります（補足図3）。葉緑体への HCO3- 拡散を促進するための受動的チャネルとして LCIAC を追加すると、この欠陥を克服できると考える人もいるかもしれません (図 2a)。ただし、ベースラインPCCMモデルにLCIACを追加したとしても、酵素活性とチャネル輸送速度の組み合わせは有効なPCCM、つまりCO2によるルビスコの半分以上の飽和を達成しません（図2bおよび補足図4）。。したがって、pH 駆動の PCCM は拡散障壁がなければ効果的に動作できません。

a〜i、ピレノイドマトリックスからのCO2拡散に対する障壁のないモデル（a〜c）を、間質内の無機炭素拡散を遅らせるチラコイドスタックを備えたモデル（d〜f）および不透過性デンプン鞘を備えたモデルと比較します。 (g – i) 空気レベル CO2 (10 μM サイトゾル) 下。 a、d、g、モデル化された葉緑体の概略図。 b、e、h、HCO3-に対するさまざまなLCIAC媒介葉緑体膜透過性およびさまざまなLCIB速度での、ルビスコが飽和した場合の最大ルビスコカルボキシル化フラックスの合計に対する比率として定義される、正規化されたCO2固定フラックスのヒートマップ。 HCO3-に対するBST媒介チラコイド膜透過性は、図1c、dと同じです。 e および h については、黒い破線の曲線は、正規化された CO2 固定フラックス 0.5 を示します。 c、f、i、HCO3-に対するさまざまなLCIAC媒介葉緑体膜透過性およびさまざまなLCIB速度における、ルビスコが飽和した場合の最大CO2固定フラックスによって正規化された、葉緑体へのHCO3-（左）およびCO2（中央）の全体的なフラックス。。負の値は葉緑体からの流出を示します。正の流入を伴う無機炭素 (Ci) 種は、Ci 源 (右) として定義されます。軸は b、e、h と同じです。

より効果的な PCCM を動作させるには、セルはピレノイドマトリックスからの CO2 漏出を削減する必要があります。 CO2 拡散に対する障壁は、さまざまな CO2 濃縮メカニズムに不可欠であると考えられてきました 44、45、46、47。マトリックスにはルビスコが密に詰め込まれていますが、我々の分析では、ルビスコが占める体積によるピレノイドマトリックス内の CO2 の拡散の遅延は、CO2 漏洩の 10% 減少しか説明できないことが示唆されています (補足注 VI.C)。したがって、モデルでは代替の障壁を考慮します。

我々は、チラコイド膜シートとピレノイドデンプン鞘が、マトリックスからの CO2 の漏出を減少させる効果的な障壁として機能すると推測しています。間質内の分子は互いに入り込んだ膜の間およびそれを通って拡散する必要があるため、チラコイド膜シートは CO2 拡散に対する効果的な障壁として機能する可能性があります 45。実際、私たちの第一原理シミュレーションは、現実的な幾何学形状48でモデル化されたチラコイドスタックが実質内でのCiの拡散を効果的に遅らせることを示唆しています（補足図5）。 PCCM におけるデンプン鞘の役割に関する証拠は限られており、さまざまです。初期の研究では、デンプンを含まないクラミドモナス変異体が空気中で正常な PCCM 性能を持つことが示唆されていましたが 49、その表現型は適切な親株と比較されていませんでした。より最近の研究では、野生型株よりもデンプン鞘が薄い変異体 (sta2-1) は、非常に低い CO250 で PCCM 効果が低下することがわかりました。後者の研究に基づいて、我々は、マトリックスを取り囲むデンプンの鞘が CO2 拡散に対する障壁として機能する可能性があると仮説を立てます。デンプン鞘は結晶性アミロペクチンの多くのラメラで構成されているため、これを 10 個の脂質二重層に相当する本質的に不透過性のバリアとしてモデル化します。その存在下では、マトリックスからの CO2 漏出のほとんどはチラコイド細管を通じて発生します (補足図 6)。

次に、上記の 2 つの現実的な拡散障壁が効果的な pH 駆動の PCCM を可能にするかどうかをテストします。上記のベースライン PCCM モデルにチラコイドスタックまたはデンプンシースのいずれかを追加すると、マトリックスから間質への CO2 漏出が大幅に減少します (補足図 7)。得られたPCCMは、空気レベルのCO2（10μMサイトゾル）条件下で非常に効果的です。ピレノイドCO2濃度は、コンパートメント間のpH差と受動的なCi取り込みのみを使用して、ルビスコの有効半飽和定数Kmを超えて上昇します（方法）（図2e）、h)。両方のバリアが存在する場合の PCCM の性能は、不透過性デンプン鞘の場合によく似ています（補足図 8）。簡単にするために、このような結合モデルについては以降の説明から省略します。

拡散バリアの要件に加えて、pH駆動PCCMの有効性は、LCIB速度とHCO3-に対するLCIAC媒介葉緑体膜透過性に依存します（図2b、e、h）。 LCIB 活性に応じて、我々のモデルは、Ci を受動的に取り込むための 2 つの異なる戦略を示唆しています。 LCIB活性が低い場合、HCO3-に対するLCIAC媒介透過性が高くなるにつれてCO2固定流束が増加し、細胞質HCO3-の間質への拡散が促進されます（図2c、f、i）。対照的に、LCIB 活性が高い場合、LCIAC 媒介の透過性が低いときに CO2 固定流束が最大になります。この場合、葉緑体への CO2 の拡散流入は、LCIB によって急速に HCO3- に変換され、HCO3- は葉緑体に捕捉されて濃縮されます。このシナリオでは、LCIACによるHCO3-に対する葉緑体膜の透過性は、間質内のLCIBによって変換されたHCO3-がサイトゾルに逆拡散することを可能にするため、有害です（図2c、f、i）。

興味深いことに、細胞質ゾルでは HCO3- が CO2 よりも豊富であるにもかかわらず、最高の CO2 固定フラックスは、LCIAC チャネルを介した受動的な HCO3- 取り込みによってではなく、LCIB の炭酸脱水酵素活性によって媒介される受動的な CO2 取り込みによって達成されます (図 2)。重要な考慮事項は、間質（pH 8）はサイトゾル（pH 7.1、参考文献54）よりも塩基性であるため、LCIBが受動的に取得したCO2をHCO3-と平衡化し、間質内でさらに高いHCO3-濃度を作り出すことができるということです。サイトゾルよりも。

受動的な CO2 取り込み戦略は、空気レベルの CO2 (10 μM サイトゾル) 下で pH 駆動の PCCM に電力を供給できますが、その Ci 取り込み速度は、葉緑体エンベロープを横切る CO2 の拡散によって最終的に制限されます。実際、私たちのシミュレーションでは、非常に低い CO2 条件 (細胞質ゾル 1 μM) 55 では、Ci 拡散に対する障壁が存在する場合でも、受動的 CO2 取り込み戦略を使用する葉緑体は最大 CO2 固定フラックスの最大 20% しか達成できないことが示されています (図3）。受動的な HCO3- 取り込みは受動的な CO2 取り込みよりも多くの Ci を集中させることができないため (図 2)、非常に低い CO2 で効果的な PCCM には能動的な Ci 輸送が必要であると仮説を立てます。この考えをテストするために、LCIB 活性のないアクティブ LCIA HCO3- ポンプ (LCIAP) を使用するモデルを検討します (図 3a、d、g)。実際、HCO3-ポンピングにより、非常に低いCO2条件下でCO2固定フラックスを飽和させることができることがわかりました（図3および補足図12）。

a〜i、ピレノイドマトリックスからのCO2拡散に対する障壁のないモデル（a〜c）、拡散障壁として機能するチラコイドスタックを備えたモデル（d〜f）、および不浸透性デンプン鞘を備えたモデル（d〜f）の結果が示されています。 g-i)。 a、d、g、受動的な CO2 取り込みに LCIB を使用する (赤)、または葉緑体エンベロープを横切る能動的な LCIAP 媒介 HCO3- ポンピングを使用し、LCIB 活性を使用しない (青) モデル化された葉緑体の概略図。空気レベルの CO2 (10 μM サイトゾル) (b、e、h) および非常に低い CO2 (1 μM サイトゾル) (c、f、i) 下での PCCM のパフォーマンスを示します。これは、正規化された CO2 固定フラックスと 1 回当たり消費される ATP によって測定されます。 a、d、g の 2 つの無機炭素取り込み戦略の場合、CO2 は固定されています。実線の曲線は、一定の正規化された CO2 固定フラックスを達成するために必要な最小エネルギーコストを示します。影付きの領域は、HCO3- 輸送速度と LCIB 速度を変化させることによって得られる可能な性能の範囲を表します。 aのようなカラーコード。 h と i では、黒い破線の曲線は、コンパートメント内での高速拡散、チラコイド膜を越える HCO3- 拡散、ピレノイド内のチラコイド細管内の CAH3 によって触媒される CO2 と HCO3- 間の高速平衡を仮定した単純化モデルの最適な PCCM パフォーマンスを示しています。 (方法)。

私たちのモデルによれば、受動的な CO2 の取り込みと能動的な HCO3 - ポンピングの両方が、空気レベルの CO2 の下で効果的な PCCM をサポートできます。ただし、後者は非可逆輸送を達成するためにエネルギーを直接消費します。能動的 HCO3- 取り込みを採用した PCCM の総エネルギーコストはいくらですか?また、このコストは受動的な CO2 取り込み戦略のコストとどのように比較されますか? これらの質問に答えるために、我々は非平衡熱力学のフレームワークを使用して、さまざまな Ci 摂取戦略のエネルギーコストを計算しました (補足注 II および図 13)56。まず、拡散障壁のない PCCM は、採用される Ci 摂取戦略に関係なく、エネルギー的に高価です (図 3a-c)。第二に、拡散障壁の存在下では、受動的な CO2 取り込み戦略は、能動的な HCO3- 取り込み戦略と同様のエネルギー効率（固定 CO2 あたり約 1 ATP コスト）を達成できることがわかります（図 3d–i）。したがって、どちらの戦略も大気レベルの CO2 で高い PCCM パフォーマンスを達成できます。ただし、より低い CO2 の下で高い効果を達成するには、積極的な HCO3- の取り込みが必要です。

細胞の原形質膜を通過する Ci 輸送は、葉緑体レベルでの実行可能な Ci 取り込み戦略にどのような影響を与えるのでしょうか? 葉緑体スケールモデルでこの疑問を調査するために、広範囲のサイトゾルCO2およびHCO3-濃度下でPCCMのパフォーマンスを評価します（補足図15）。当然のことながら、特定の葉緑体 Ci 取り込み戦略のパフォーマンスは、その標的となる Ci 種の細胞質ゾルレベルに応じて増加することがわかりました。したがって、葉緑体に取り込まれたサイトゾルの Ci 種を補充することが重要です。さらに、サイトゾルの Ci プールの構成に関係なく、受動的な CO2 取り込みと能動的な HCO3- 取り込みの両方が欠如している葉緑体は、サイトゾルの CO2 濃度が 100 μM 以上でない限り、高い PCCM 効果を達成できません。このようなプールを作成すると、おそらく原形質膜を横切るかなりの CO2 漏洩が発生し、したがってエネルギーコストが高くなるでしょう。したがって、外部環境からサイトゾルへ、およびサイトゾルから葉緑体への Ci 取り込みの効果的なメカニズムは、両方とも高い PCCM パフォーマンスにとって不可欠です。

これまでのところ、我々は空気レベル CO240,57 の下でクラミドモナスに存在すると考えられる炭酸脱水酵素の局在パターンのみを考慮してきました。このような局在化の利点を評価するために、各炭酸脱水酵素の分子の総数を維持しながら、CAH3およびLCIBの局在化を変化させます（図4a）。我々は、異所性炭酸脱水酵素の局在化が PCCM のパフォーマンスを損なうことを発見しました。まず、塩基性ピレノイドマトリックス（pH 8）に誤って局在化したLCIBは、ルビスコの基質CO2をHCO3-に変換し、したがってCO2固定を減少させます（図4b〜f、領域i）。第二に、CAH3がピレノイドの外側のチラコイドに分布している場合、このCAH3によって生成されたCO2分子は間質に直接拡散する可能性があり、ピレノイドに集中する可能性が低くなり、したがってPCCMの有効性が低下します（図4b-f）。、領域ii、および補足図16）。さらに、ピレノイド外側のCAH3の誤った局在化は、間質とチラコイド間のCiの無駄な循環の増加につながるため、PCCM効率を低下させ、区画間のpH差を維持するために必要なエネルギーコストを増加させます。最後に、CAH3をピレノイドの中心にあるチラコイド内腔の小さな領域に集中させると、HCO3-がCO2に変換される前に拡散する必要がある距離が長くなり、CAH3によるCO2生成フラックスが低下します（図4b〜f、領域） iii）。これらの結果はすべて、受動的な CO2 取り込みを使用する空気レベル CO2 (図 4) と、能動的な HCO3- 取り込みを使用する非常に低い CO2 (補足図 17) の両方に当てはまります。したがって、我々のモデルは、炭酸脱水酵素の適切な局在化が全体的な PCCM パフォーマンスにとって重要であることを示しています。

a、炭酸脱水酵素のさまざまな局在の概略図。 CAH3 ドメインはピレノイド内尿細管の中心 (半径 r = 0) で始まり、LCIB ドメインは葉緑体エンベロープで終わります。図 1d のようなカラーコード。オレンジ色は CAH3 が占める領域を示します。 b〜e、CAH3の終了半径とLCIBの開始半径は、空気レベルのCO2下で受動的なCO2取り込み戦略を採用したモデル化された葉緑体で変化しており、チラコイドスタックが間質内の無機炭素の拡散を遅らせている（b、c）、または不浸透性のデンプン鞘を備えている(d、e)。炭酸脱水酵素の局在を変化させた場合の、正規化された CO2 固定フラックス (b、d) および CO2 固定あたり消費される ATP (c、e)。 f、b〜eに示されている局在パターン（i〜iii）の無機炭素フラックスの概略図。 aおよび図1dのようなカラーコード。 b ～ e の点線の目盛りは、a と同様にピレノイド半径を示します。シミュレーションパラメータは図1c、dと同じです。

空気レベルから非常に低レベルの CO2 (約 1 μM 溶解) に移行すると、クラミドモナスは LCIB を間質全体の拡散からピレノイド周縁周囲の局在に再局在化します 57。非常に低い CO2 の下でのピレノイド周辺への LCIB 局在の価値をよりよく理解するために、LCIB が葉緑体エンベロープに向かってどれだけ伸びるかを定義する間質 LCIB の端半径と、デンプン鞘バリアと能動的な HCO3- 取り込み (図 5a)。私たちの分析は、濃縮されたCO2が葉緑体から漏れ出すことを許可するのはエネルギー的に無駄であることを示しています（補足図13）。その結果、デンプン鞘近くに再局在化したLCIBは、マトリックスから拡散するCO2分子を再捕捉し、葉緑体内でHCO3-として捕捉することにより、エネルギー効率を向上させます（図5b〜c、領域i）。 CO2 を回収するための LCIB がない場合（図 5b–c、領域 iii）、または流入する HCO3- が葉緑体膜付近で CO2 に変換され、そこから漏れて戻ってくる可能性がある拡散間質 LCIB がある場合、エネルギーコストはより高くなります。サイトゾル（図5b〜c、領域ii、および補足図19）。したがって、我々のモデルは、非常に低い CO2 の下でピレノイドの周囲に強力な CO2 拡散障壁が存在する場合、LCIB をピレノイド周辺に局在させることで効率的な Ci リサイクルが可能になり、その結果 PCCM の性能が向上することを示唆しています。

a、不透過性デンプン鞘と、非常に低いCO2下で葉緑体エンベロープを横切る活性HCO3-ポンピングを使用する、モデル化された葉緑体におけるLCIBの様々な活性と末端半径の概略図。図4aのようなカラーコード。 LCIB ドメインはピレノイド半径 (b および c の x 軸の 0.3) で始まります。 b、c、LCIB の指定された特性が変化した場合の正規化された CO2 固定フラックス (b) および CO2 固定ごとに消費される ATP (c)。 d、b および c に示す LCIB 状態 (i ～ iii) の無機炭素フラックスの概略図。図4fのようなカラーコード。図 4 のようなシミュレーションパラメータ。アクティブな LCIAP 媒介 HCO3− ポンピングは、レート \(\kappa _{{{{\mathrm{chrom}}}}}^{H^ - }\) = 10−4 で表されます。 m s−1、可逆性 γ = 10−4。正規化された CO2 固定フラックスの顕著な変動を示すために、チラコイド細管が短縮されたモデルがシミュレートされます (方法)。定性的な結果は、この特定の選択に関係なく当てはまります。

PCCM機能に対するチラコイド内腔と間質のpHの影響を決定するために、2つのコンパートメントのpH値を変化させます（図6および補足図20）。 Ci摂取戦略に関係なく、モデル化されたPCCMは、チラコイド内腔が間質よりもはるかに酸性である場合にのみ高い有効性を達成することがわかりました（図6a、d）。実際、低 pH 間質 (図 6、領域 i) または高 pH ピレノイド尿細管内腔 (図 6、領域 ii) における炭酸脱水酵素活性は、それぞれ、体内の HCO3- または CO2 の濃度を低下させます。それらのコンパートメント。どちらも PCCM にとって有害です。興味深いことに、pHの変化は、受動的CO2取り込みを採用するPCCM（図6a〜c）と能動的HCO3−ポンピングを採用するPCCM（図6d〜f）のエネルギー効率に異なる影響を与えます。具体的には、間質の pH が比較的低い場合、後者のみがエネルギーコストの大幅な増加を示します。この場合、間質に送り込まれたほとんどのHCO3-はCO2に変換され、その後サイトゾルに失われます（図6e、f、領域iおよびii）。したがって、我々の結果は、高い PCCM 性能には、高 pH 間質と低 pH チラコイド内腔の維持が必要であることを示唆しています。

a〜f、チラコイド内腔と間質のpH値は、空気レベルのCO2下で受動的なCO2取り込みを採用した不透過性デンプン鞘を持つモデル化された葉緑体で変化します（a〜c）（10μMサイトゾル;パラメータは図4dと同様） e）または非常に低いCO2下でのアクティブなHCO3-ポンピング（d〜f）（1μMサイトゾル、補足図17c、dのパラメーター）。正規化された CO2 固定フラックス (a、d) と CO2 固定当たり消費される ATP (b、e) を 2 つのコンパートメントの pH 値の関数として示します。 c、f、a、b、d、およびeで示されるpH値の無機炭素プールおよびフラックスの概略図。白い星は、他のすべてのシミュレーションで使用されるベースライン pH 値を示します。

次に、私たちのモデルが既知のクラミドモナス PCCM 欠損変異体の表現型を説明できるかどうかを検討します。クラミドモナスのPCCMが空気レベルCO2下での受動的なCO2取り込みから、非常に低いCO2下での能動的なHCO3-取り込みに切り替わると仮定して、各変異の影響を最もよく表すモデルパラメータを選択します（補足図23および24）。我々のシミュレーション結果は、公表されているすべての変異体についての実験結果と半定量的な一致を示し(補足表5)、記録されたすべての表現型の機構的な説明を提供します。たとえば、我々のモデルは、おそらく受動的な CO2 取り込みの欠陥により、lcib 変異体が空気中で増殖できないことを捉えています。この表現型は、HCO3- ポンピングを利用するモデル化された lcib 変異体が空気中で増殖を促進するのに十分な効果のある PCCM を持っているため、クラミドモナスが空気レベル CO2 の下では HCO3- を葉緑体にポンピングしないことを意味します。特に、lcib 変異体は非常に低い CO2 下で増殖を回復します。これは、この条件下での HCO3- 取り込みシステムの活性化によるものであると考えられます 22,57,58。実際、lcib 変異体バックグラウンドで LCIA HCO3- トランスポーターをコードする遺伝子をノックダウンすると、非常に低い CO257 の下で CO2 固定と増殖が劇的に減少します。

より広範には、我々のモデルは、細胞膜にある HCO3- トランスポーター HLA3 または CO2 トランスポーター LCI1 を欠くクラミドモナス変異体の表現型を再現しています。実際、HLA3をコードする遺伝子（サイトゾルHCO3-の低レベルとしてシミュレート）のノックダウンは、非常に低いCO2下でPCCMの有効性の劇的な低下につながります。これは、おそらく細胞への、ひいては葉緑体へのHCO3-の輸送の減少によるものと考えられます23,24。対照的に、lci1 単一変異体は、おそらくサイトゾルへの、したがって葉緑体への CO2 流入の減少のため、大気レベル CO2 の下で PCCM 効果の適度な低下を示しますが、おそらく非常に低い CO2 の下では PCCM に影響を与えません。この条件下では、能動的な HCO3- 取り込みシステムが活性化されます 34。

最後に、我々のモデルは、クラミドモナスのデンプン変異体の表現型を捉えています。クラミドモナスは、大気中と非常に低いCO2条件の両方で生存できますが、これはおそらくチラコイドスタックがデンプン鞘の非存在下でピレノイドからのCO2漏出を効果的にブロックできるためと考えられます。チラコイドスタックなどの非デンプン拡散障壁の存在は、他のピレノイド含有藻類がデンプン鞘を持たない理由の説明にも役立つ可能性があります59。

我々のモデルにおける Ci フラックスの分析は、クラミドモナスのピレノイドを横断するチラコイド細管が間質 HCO3- をピレノイドに送達し、そこで CAH332 によって CO2 に変換できるという長年の見解を裏付けています、60。しかし、クラミドモナス様のチラコイド構造は機能的な PCCM に必要なのでしょうか? 確かに、真核生物の藻類は、ピレノイドを通過する複数の非接続平行チラコイドスタック、ピレノイドマトリックスを二分する単一ディスクのチラコイド、またはピレノイドを横切っていないが取り囲むチラコイドシートなど、さまざまなチラコイド形態を示します61,62,63,64。。私たちの計算は、HCO3-が低pHチラコイド内腔に拡散でき、チラコイド炭酸脱水酵素がピレノイド近位内腔に局在している限り、さまざまなチラコイド形態が原理的に効果的なPCCMの機能をサポートできることを示しています（補足図25））。

私たちのモデルは、CO2 を効果的に濃縮するのに十分な最小限の PCCM 構成を特定します。次に、同じ最小限の要素の代替構成で効果的な PCCM を実現できるか、と考えます。我々は、受動的Ci取り込み戦略を採用するPCCMに焦点を限定します。ルビスコ、チラコイドおよび間質炭酸脱水酵素、チラコイド膜および葉緑体エンベロープ上の HCO3- チャネル、および拡散バリアの存在と局在を変化させて、空気中で 216 の部分 PCCM 構成の有効性とエネルギーコストを測定しました（補足図 26）。。

我々の結果は、効果的なpH駆動PCCMの3つの中心モジュールを要約しています（図7a）：（i）受動的に取得されたCO2をHCO3-に変換する間質炭酸脱水酵素（LCIB）、（ii）チラコイド膜HCO3-チャネル（BST）ルビスコ付近で HCO3- から CO2 への変換を可能にする管腔炭酸脱水酵素 (CAH3)、および (iii) 拡散障壁に囲まれたルビスコ凝縮物。これらのモジュールのいずれかが欠けている PCCM 構成では、CO2 を濃縮する能力が損なわれることがわかりました (図 7b)。クラミドモナス様 PCCM 構成は、3 つのモジュールすべてを備えた唯一の構成です。したがって、この構成は十分であるだけでなく、考慮された最小限の要素を使用して効果的な PCCM を実現するためにも必要です。

a、指定された機能を備えた 3 つの必須モジュールの回路図 (図 1a と同じスタイル)。クラミドモナスでは、LCIB は CO2 の受動的取り込みに使用でき、CO2 は HCO3- として間質に捕捉されます (モジュール i)。 BST は間質 HCO3- をチラコイド内腔に拡散させ、そこで CAH3 が HCO3- を CO2 に変換します (モジュール ii)。そして、デンプン鞘とチラコイドスタックは、ピレノイドマトリックスからの CO2 の流出を遅らせる拡散障壁として機能する可能性があります (モジュール iii)。 b、それぞれのモジュールなし（左、灰色）またはあり（右、色付き）の CCM 構成の正規化された CO2 固定フラックスのヒストグラム。モデル内の酵素、HCO3-チャネル、および拡散障壁の存在および/または局在を変化させることにより、216 個の CCM 構成をテストしました（補足図 26 を参照）。

ほとんどの作物を含む多くの陸上植物には、いかなる形の CCM も欠如していると考えられています。私たちの分析は、典型的な植物の葉緑体構成がルビスコを通る最大 CO2 固定フラックスの約 30% しかサポートできないことを示しています (補足表 6)。 PCCM を作物に組み込むことは、CO2 固定の強化を通じて収量を増加させる有望な戦略として浮上しています 30,31。植物における個々の PCCM 成分の発現 65 やピレノイドマトリックスの再構成 66 などの初期の工学的進歩にもかかわらず、植物の葉緑体で効果的な PCCM を確立するために必要な工学ステップの最適な順序は依然として不明です。ここでは、部分的な PCCM 構成を活用して、効率を単調に改善し、過剰なエネルギーコストを回避するエンジニアリングパスを提案します。

私たちの知る限り、植物の葉緑体は間質に拡散炭酸脱水酵素と拡散植物ルビスコを含み、HCO3- チャネルと拡散障壁がありません 67。植物ルビスコはクラミドモナスルビスコよりも CO2 の Km が低いことに注目します。私たちの工学計算ではこれを考慮し、ルビスコ工場からの値を採用しています。研究では、天然の植物の炭酸脱水酵素がチラコイド内腔に拡散していることも示唆されており 68、したがってモデル化された植物の葉緑体構成ではそれが想定されています（図 8、開始時の構成）。この構成には、効果的な PCCM (図 7a) に必要な 3 つの必須モジュールのうちの 1 つ、つまり受動的 CO2 吸収システムのみが含まれています。

a、上: 拡散チラコイド炭酸脱水酵素、拡散間質炭酸脱水酵素、および拡散ルビスコを含み、HCO3- 輸送体および拡散障壁を欠く、典型的な植物葉緑体を表す開始配置の概略図。下：受動的なCO2取り込み戦略とデンプン鞘を採用したクラミドモナスの葉緑体を表す望ましい構成（図2gと同様）。 b、指定された変更を実装した後のさまざまな構成の正規化された CO2 固定フラックス (円、大きさに比例する面積) と CO2 固定ごとに消費される ATP (正方形、大きさに比例する面積) を示すベン図。矢印は、開始構成を目的の構成に変換するための提案された一連のステップを示します (本文を参照)。開始時の構成では、正規化された CO2 固定フラックスは 0.31 で、ATP コストは無視できます。 CO2 固定あたり 0.25 ATP 未満のすべてのコストは、最小サイズの正方形で表されます。

残りの 2 つのモジュールをインストールしてクラミドモナス様の PCCM 構成 (図 8、目的の構成) を実現するためのすべての可能な段階的パスを検討した後、4 つの最小限のエンジニアリングステップ (図 8b、矢印) からなる次のパスを提案します。最初のステップは、植物ルビスコのピレノイドマトリックスへの局在化です。マトリックス中のルビスコの密な充填により、約 80 kDa を超えるタンパク質複合体が排除されると思われるため、植物間質炭酸脱水酵素は本質的に排除されると考えられます 26,69。第 2 ステップは、マトリックスに隣接する、またはマトリックスを横切るチラコイドへのチラコイド炭酸脱水酵素の局在化です。これらの最初の 2 つのステップでは、PCCM の有効性や効率に目立った変化は生じません。次のステップは、チラコイド膜に HCO3- チャネルを導入することです。これにより、CO2 固定流束が開始時の構成の約 175% に増加します。このステップにより、PCCM のコストも CO2 固定当たり約 4 ATP に増加します。このような高コストのステップは回避できず、各ステップで効率が向上する他のすべての可能なパスは、よりコストのかかる中間構成になります（図8bおよび補足表6）。工学的に重要なことは、このステップによって生じる CO2 固定フラックスの増加は、設置されたチャネルが機能しているという証拠を提供することです。提案された経路の最終ステップは、ピレノイドマトリックスからの CO2 漏出をブロックするデンプンシースを追加することです。これにより、開始時の構成と比較して CO2 固定流束が 3 倍になり、コストが CO2 固定あたりわずか 1.3 ATP に削減されます。

4 つの最小限のエンジニアリングステップに対して別の実装順序を選択すると、中間段階での PCCM のパフォーマンスの低下につながります。たとえば、間質およびチラコイド炭酸脱水酵素が局在化する前にチラコイド膜に HCO3- チャネルを追加すると (図 8b、青い楕円)、重複する炭酸脱水酵素によって無駄なサイクリングが生成されます (図 4、領域 ii)。さらに、HCO3-チャネルがチラコイドに追加される前にデンプンシースを追加すると、CO2固定が減少する可能性があります（図8b、灰色の楕円形）。チャネルがなければ、HCO3- はチラコイド炭酸脱水酵素に容易に拡散して CO2 を生成できず、デンプン鞘は間質からルビスコへの CO2 の拡散を妨げます。したがって、私たちが提案するパスは、効率の低下や過剰なエネルギーコストを伴う中間構成を回避します。

最小 PCCM の組成と機能をより深く理解するために、クラミドモナス PCCM に基づいてマルチコンパートメント反応拡散モデルを開発しました。このモデルは、公表されているすべてのクラミドモナス PCCM 変異体を説明するだけでなく、最小限の PCCM の動作原理を理解するための定量的および生物物理学的基礎も築きます。モデルの体系的な分析により、効果的でエネルギー的に効率的な PCCM の鍵は、ピレノイドマトリックスからの CO2 流出を防ぐ障壁と、無駄な Ci フラックスを防ぐ炭酸脱水酵素の局在化であることが示唆されています。このモデルは、大気レベルの CO2 での受動的な CO2 取り込みの実現可能性を実証し、外部 CO2 レベルが低い場合、効果的な PCCM には HCO3- の積極的な導入が必要であることを示しています。どちらの摂取戦略も、低いエネルギーコストで機能します。

私たちのモデルでは明示的に考慮されていませんが、プロトンはルビスコ触媒による CO2 固定反応 5 で生成され、CAH3 触媒による HCO3 から CO2 への変換で消費されます。その後、生理学的 pH 値を維持するには、ピレノイドマトリックスでプロトンを枯渇させ、ピレノイド内のチラコイド内腔にプロトンを補充する必要があります 41,43。ただし、フラックスバランス分析では、自由プロトンの濃度が低すぎて、自由プロトンの拡散による予想されるプロトンの枯渇/補充フラックスを考慮できないことが示されています（補足注VI.Dおよび図27）。したがって、プロトンを効率的に輸送するには、別のメカニズムを使用する必要があります。最近のモデリング研究によって示唆された 1 つの可能性 70 は、RuBP や 3-PGA などのプロトンキャリアがミリモル濃度で存在する可能性があり 71、したがってコンパートメント間でプロトンを輸送するのに十分な流束を可能にする可能性があるということです。プロトン輸送の根底にある分子機構を理解することは、将来の研究にとって重要なテーマとなるでしょう。

別のクラスの CCM は、シアノバクテリアによって使用されるカルボキシソームベースの CCM (CCCM) です 13。 CCCM では、HCO3- は能動輸送を介して細胞質ゾルに濃縮され 72、カルボキシソーム内に拡散します。カルボキシソームは通常直径 100 ～ 400 nm のコンパートメントであり、各コンパートメントはルビスコを囲む正二十面体タンパク質の殻で構成されています 73。タンパク質の殻は、効果的な CCCM に必要な拡散障壁として機能すると考えられています 46,47。ピレノイドマトリックスには炭酸脱水酵素がないようですが、カルボキシソームマトリックスには HCO3- を CO2 に変換してルビスコに局所的に供給する炭酸脱水酵素が含まれています。最近の研究では、ルビスコのカルボキシル化中に生成されるプロトンがカルボキシソームを酸性化し、その結果、炭酸脱水酵素触媒による CO270 の生成が促進される可能性があることが示唆されています。「CCCM と比較して PCCM を運用する利点は何ですか?」と疑問に思う人もいるかもしれません。 1 つの可能性は、PCCM がより複雑な空間構成を使用してルビスコをチラコイド内腔炭酸脱水酵素から分離し、これにより 2 つの酵素がそれぞれの触媒機能に最適な pH 値で動作できるようにするというものです。したがって、ルビスコ付近で十分な CO2 を生成するには、PCCM は CCCM よりも小さい Ci プールを必要とする可能性があります。実際、シアノバクテリアはおよそ 30 mM の細胞内 HCO3-74,75 を蓄積するようですが、クラミドモナスはわずか 1 mM の内部 HCO3- プールを作成します 76。 PCCM と CCCM のパフォーマンスを比較する将来の実験により、2 つの異なるメカニズムについての理解が進むでしょう。

PCCM は作物植物に導入されて収量を向上させる可能性があります。私たちのモデルは、PCCMの有効性とエネルギー効率の両方を考慮して全体的なパフォーマンスを評価するためのフレームワークを提供し（補足図28）、エンジニアリングステップの好ましい順序を提案することができます。さらに、私たちのモデルは、機能する PCCM の最小限の設計を提供することで、エンジニアが潜在的な課題を絞り込むのに役立つと期待しています。天然の植物の炭酸脱水酵素が不活性であるか存在しない場合は、既知の活性を持つ他の炭酸脱水酵素を発現させ、局在化させることが望ましいと考えられます。さらに、重要なステップは、異種発現されたクラミドモナス BST チャネルが HCO3- チャネルとして機能するかどうかをテストし、それらが植物の天然イオンチャネルを妨げないことを確認することです。私たちは、このモデルが最小限の PCCM をプラントに導入することを目指すエンジニアに実用的な情報を提供し、将来の基本的な PCCM 研究を導くための有用な定量的ツールとして機能することを願っています。

PCCM の動作をより深く理解するために、クラミドモナスにおける仮定されたメカニズムに基づいてマルチコンパートメント反応拡散モデルを開発しました。このモデルでは、主要な PCCM 酵素とトランスポーター、およびクラミドモナス葉緑体の関連構造が考慮されています 48。簡単にするために、私たちのモデルは球対称であると仮定し、無限のサイトゾル内の半径 Rchrom の球形の葉緑体を考慮します。したがって、すべてのモデル量は、葉緑体の中心からの半径距離 r の関数として表現できます (図 1b)。モデル化された葉緑体は 3 つのコンパートメントで構成されています。中心には半径 Rpyr (pH 8) の球形のピレノイドマトリックスがあり、その周囲を間質 (pH 8) が取り囲み、チラコイド (内腔 pH 6) がマトリックスと間質の両方を横切っています (図 1)。 41、42、43。定常状態では、流束平衡方程式により、それぞれのコンパートメント内の CO2、HCO3-、および H2CO3 の空間依存濃度が設定されます (下付き文字で示されています。補足表 2 および注 I を参照)。

ここで、C は CO2 の濃度を示し、H は高速平衡状態にあると仮定される HCO3- と H2CO3 の合計濃度を示します77。したがって、それぞれの濃度は、HCO3− および \(H^0 = \frac{1}{{1 + \eta }}H\) H2CO3 の場合、η = \(10^{{\mathrm{pH-pKa}}_1}\) は pH 依存の分配係数、pKa1 = 3.4 は最初の酸の負の対数です。 H2CO378 の解離定数。方程式 (1a ～ 1f) の最初の項は、区画内の無機炭素 (Ci) の拡散流束を表します。 DC と DH はそれぞれ、水溶液中での CO2、HCO3- と H2CO3 を合わせた拡散係数を示します。間質内のCi拡散を遅らせるチラコイドスタックを備えたモデルでは、標準的な均質化アプローチを使用して有効拡散係数DstrC/Hが得られます（補足図5および注IGを参照）。それ以外の場合は \(D_{{{{\mathrm{str}}}}}^{C/H} = D^{C/H}\)。式 (1a ～ 1f) の他のフラックス項 (jX) は酵素反応とコンパートメント間の Ci 輸送を表し、因子 fs と fv はチラコイドの幾何学的形状を表します。それらの式については、後続のセクションで説明します。

r = Rpyr における境界条件は、マトリックスと実質の界面でデンプン鞘を横切る Ci の拡散流束によって決定されます。

ここで、∂r は r に関する微分値を表し、デンプン鞘はすべての Ci 種に対して同じ透過率 κstarch を持つと仮定されます。澱粉鞘がなく、Ci がマトリックスの外に自由に拡散できる場合、κ澱粉→∞。 κstarch = 0 は、不透過性のデンプン鞘を表します（補足注 IF を参照）。同様に、葉緑体エンベロープを横切る Ci 輸送フラックスは、r = Rchrom での境界条件をもたらします。つまり、

ここで、 \(\kappa _{{{{\mathrm{chrom}}}}}^{H^ - }\) と γ は、サイトゾルからの内向き HCO3- 輸送の速度と可逆性を示し、未特徴の葉緑体の作用を表します。エンベロープ HCO3- トランスポーター LCIA24,37; γ = 1 はパッシブ双方向チャネルに対応し、γ < 1 はアクティブポンプに対応します。外部 CO2 条件は、サイトゾル CO2 濃度 Ccyt によって指定されます。大気レベルの CO2 条件では Ccyt = 10 μM、非常に低い CO2 条件では Ccyt = 1 μM に設定します。特に指定のない限り、すべてのサイトゾル Ci 種は pH 7.154 で平衡状態にあると想定されます。

チラコイドの幾何学的形状は、クラミドモナスの低温電子断層撮影法によって特徴付けられています 48。私たちのモデルでは、チラコイドの局所体積分率 fv と表面対体積比 fs を変化させることで、この幾何学形状を考慮します。これらの分数は、ピレノイドの中心にある細管メッシュワーク (r ≤ Rmesh) を表し、Ntub 円筒形細管によって放射状に拡張され、それぞれの半径は atub (補足ノート IC を参照)、つまり、

ベースラインモデルでは、チラコイド尿細管は葉緑体エンベロープ、つまり尿細管の外半径 Rtub = Rchrom まで延びていると想定されます。より短い尿細管を持つモデルでは、\(R_{{{{\mathrm{tub}}}}} = 0.4\,R_{{{{\mathrm{chrom}}}}}\) を選択し、fv = を設定します。 r > Rtub の場合は 0 および fs = 0。したがって、式 (1) のラプラスベルトラミ演算子は \(\nabla _{{{{\mathrm{thy}}}}}^2 = r^{ - 2}f_{{{\mathrm{v }}}}^{ - 1}\partial _rf_{{{\mathrm{v}}}}r^2\partial _r\) チラコイド尿細管の場合、および \(\nabla _{{{{\mathrm{ pyr}}}}}^2 = \nabla _{{{{\mathrm{str}}}}^2 = r^{ - 2}(1 - f_{{{\mathrm{v}}}})マトリックスとストロマの場合は ^{ - 1}\partial _r(1 - f_{{{\mathrm{v}}}})r^2\partial _r\)。

このモデルでは、3 つの重要なクラミドモナス PCCM 酵素、つまり炭酸脱水酵素 (CA) CAH3 および LCIB、および CO2 固定酵素 Rubisco を考慮しています。 CO2 と HCO3- の間の相互変換は両方の CA によって触媒され、可逆的なミカエリス・メンテン反応速度論に従います 79。 CA を介した CO2 から HCO3- への変換率は次の式で与えられます。

ここで、\(V_{{{{\mathrm{max}}}},{{{\mathrm{CA}}}}^C\) は CA の最大レートを表し、\(K_{{{\mathrm{m }}}}^C\) と \(K_{{{\mathrm{m}}}}^{H^ - }\) はそれぞれ CO2 と HCO3− の半飽和濃度を示し、\(V_{{ {{\mathrm{max}}}},{{{\mathrm{CA}}}}^C/K_{{{\mathrm{m}}}}^C\) は 1 次の速度定数を示します。これを CA の「レート」と呼びます (図 2)。最後に、 \(K^{{{{\mathrm{eq}}}}} = 10^{{{{\mathrm{pK}}}}_{{{{\mathrm{eff}}}}} - { {{\mathrm{pH}}}}\) は CO2 と HCO3- の平衡比を示し、有効 pKa は \({{{\mathrm{pK}}}}_{{{{\mathrm {eff}}}}} = 6.1\)8 局在化関数 \({{{\mathcal{L}}}}_{{{{\mathrm{CA}}}}\) は、CA が存在する r では 1 に等しく、それ以外の場合は 0 に等しくなります。 CO2 から HCO3 への非触媒自発速度は、一次速度定数 \(k_{{{{\mathrm{sp}}}}^C\) で、 \(j_{{{ {\mathrm{sp}}}}} = k_{{{{\mathrm{sp}}}}^C(C - K^{{{{\mathrm{eq}}}}}H^ - )\ ) 82. jCA と jsp の負の値は CO2 から HCO3- への変換のフラックスを示すことに注意してください。

Rubisco によって触媒される CO2 固定速度は次のように計算されます。

ここで、\(V_{{{{\mathrm{max}}}},{{{\mathrm{Rbc}}}}}^C\) は最大レート、実効 Km (図 1 の Rubisco Km) を表します。 ). ) は \(K_{{{\mathrm{m}}}}^{{{{\mathrm{eff}}}}} = K_{{{{\mathrm{m}}}},{ で与えられます{{ \mathrm{Rbc}}}}^C(1 + O/K_{{{{\mathrm{m}}}},{{{\mathrm{Rbc}}}}}^O)\) にO283.84 による競合阻害を説明します。ここで、O は O2 の濃度を示し、\(K_{{{{\mathrm{m}}}},{{{\mathrm{Rbc}}}}}^C\) \ (K_{{{{\mathrm{m}}}}, {{{\mathrm{Rbc}}}}}^O\) は、それぞれ CO2 と O2 の半飽和基質濃度を示します。 \({{{\mathcal{L}}}}_{{{{\mathrm{Rbc}}}}}\) は、Rubisco が局所化されている場合は 1 に等しく、それ以外の場合は 0 に等しくなります。

私たちのベースラインモデルでは、CAH3はピレノイドを横切るチラコイド細管に局在し40、LCIBは間質に拡散して分布し57、ルビスコはピレノイドマトリックスに局在すると仮定しています16。酵素の局在化の効果を調べるために、分子の数を一定に維持しながら、酵素の開始半径と終了半径を変更します（図4および5、および補足ノートIII）。

チラコイド内腔から基質または間質までチラコイド膜を横切って拡散する CO2 の流束は、次の式で与えられます。

ここで、κC はチラコイド膜の CO2 透過性を示します。同様に、HCO3− と H2CO3 の膜貫通拡散束 \(j_{{{{\mathrm{mem}}}}^H\) は次のように与えられます。

ここで、\(\kappa^{H^-}\) と \(\kappa^{H^0}\) はそれぞれ HCO3- と H2CO3 に対するベースラインの膜透過性を示し、\(\kappa _{{{{\mathrm) {thy}}}}}^{H^ - }\) は、ベストロフィン様チャネルによる HCO3- に対するチラコイド膜の追加の透過性を示します 25。方程式 (1a) と (1a–1c) の最終項は \(\frac{{f_{{{\mathrm{v}}}}}}{{1 - f_{{{\ mathrm{v}}}}}}\) 膜貫通フラックスは、体積分率が小さいチラコイドコンパートメントの濃度に大きな影響を与えるためです。

モデルパラメータは、LCIBおよびCAH3の速度およびHCO3-トランスポーターの動力学パラメータを除き、実験から推定された(補足表2およびその中の参考文献を参照)。これらは不明である。これらの未知のパラメータについて、妥当な値の範囲内で体系的なスキャンを実行しました（図2および補足図4）。式（１）の数値解は、有限要素法を用いたシミュレーションを実行することによって得られた。偏微分方程式は同等の弱い形式に変換され、1 次要素によって計算的に離散化され 85、オープンソースコンピューティングプラットフォーム FEniCS86 に実装されました。モデル結果の堅牢性を検証するために、パラメーター感度分析が実行されました (補足図30)。十分な空間離散化を確保するために、収束研究が実行されました（補足図31）。

非平衡熱力学のフレームワークを使用してエネルギーコストを計算しました 56 (詳細については補足注 II.B を参照)。簡単に言うと、非平衡プロセス (反応、拡散、または輸送) の自由エネルギーコストは、(j+ −j−)ln(j+/j−) (熱エネルギー RT の単位) で与えられます。ここで、j+ と j−はそれぞれ順方向および逆方向の磁束を示します。式 (1) で説明した非平衡プロセスのエネルギーコストを合計すると、PCCM の動作に必要な総エネルギーは次のように近似できることがわかります (RT 単位)。

ここで、 \(J_{{{{\mathrm{str}}}}}^{C\to H^ - } = - {\int}_0^{R_{{{{\mathrm{塩素}}}}} } {4\mathrm{\pi} r^2(1 - f_{{{\mathrm{v}}}})(j_{{{{\mathrm{LCIB}}}}} + j_{{{{\ mathrm{sp}}}}})dr}\) は、間質における CO2 から HCO3− への LCIB 媒介および自発的変換の流量を積分します。幾何学的因子は 4πr2(1 − fv)dr です。 \(J_{{{{\mathrm{塩素}}}}^C = 4\pi R_{{{{\mathrm{塩素}}}}}^2\kappa ^C(C_{{{{\mathrm {str}}}}}|_{r = R_{{{{\mathrm{塩素}}}}}} - C_{{{{\mathrm{cyt}}}}}\) は拡散する CO2 の流束を示します間質からサイトゾルに戻ります。 \(J_{{{{\mathrm{Rbc}}}}} = {\int}_0^{R_{{{{\mathrm{chrom}}}}}} {4\pi r^2(1 - f_ {{{\mathrm{v}}}})j_{{{{\mathrm{Rbc}}}}}dr}\) は、Rubisco による CO2 固定のフラックスを積分します。 lnγ−1 と \({{{\mathrm{ln}}}}({K_{{{{\mathrm{thy}}}}}^{{{{\mathrm{eq}}}}}}/ {K_{{{{\mathrm{str}}}}}^{{{{\mathrm{eq}}}})\) 項は、葉緑体のエンベロープ全体に HCO3- を送り出す自由エネルギーコストを示します。それぞれチラコイド膜を横切るプロトン。 ATP 加水分解エネルギー \(|{\Delta}G_{ATP}|=51.5\,RT\)87 を使用して、\(\dot W_{{{{\mathrm{PCCM}) として固定された CO2 あたりに消費される等価 ATP を計算します。 }. }}}/J_{{{{\mathrm{Rbc}}}}}/|{\Delta}G_{{{{\mathrm{ATP}}}}}|\)。

PCCM の生物物理学的限界をよりよく理解するために、完全なモデルの十分に混合されたコンパートメントの単純化を検討します。具体的には、(i) マトリックスおよびストロマ内での Ci の拡散が速いため、CO2 と HCO3− の濃度は 2 つのコンパートメントのそれぞれの半径にわたって一定であり、\(C_{{{ {\mathrm{pyr}}}},C_{{{{\mathrm{str}}}}},H_{{{{\mathrm{pyr}}}}}^ -\) および \(H_{{ {{\mathrm{str}}}}}^ -\); (ii) チラコイド膜を通過する HCO3- 輸送は速いため、ピレノイド内の HCO3- のチラコイド尿細管濃度は \(H_{{{\mathrm{pyr}}}}}^ -\) に等しくなります。ピレノイドの外側のチラコイド尿細管の濃度は \(H_{{{{\mathrm{str}}}}}^ -\) に等しい。 (iii) HCO3- と CO2 はピレノイド内部のチラコイド細管内で平衡状態にあり (CAH3 によって触媒される)、よってその中の CO2 濃度は \(C_{{{{\mathrm{thy}}}}} = K_ {{{{\mathrm{thy}}}}}^{{{{\mathrm{eq}}}}}H_{{{{\mathrm{pyr}}}}}^ -\); (iv) チラコイド細管内の CO2 濃度は、葉緑体エンベロープに向かって Cstr に近づきます。したがって、磁束平衡条件は 4 つの変数からなる一連の代数方程式 \(C_{{{{\mathrm{pyr}}}}},C_{{{{\mathrm{thy}}}}} によって記述されます,C_{{{{\mathrm{str}}}}}\) および \(H_{{{{\mathrm{str}}}}}^ -\) (補足ノート IV および V を参照)。代数方程式は、Python ベースのコンピューティングライブラリ SciPy (バージョン 1.5.0) を使用して解きます88。よく混合されたコンパートメントモデルのエネルギーコストは、上記と同様に計算されます。

私たちは、個々のコンポーネントの追加と削除が PCCM の全体的な機能にどのような影響を与えるかに興味があります。したがって、酵素、HCO3- チャネル、拡散障壁の存在と局在を調節する 216 個の PCCM 構成の有効性とエネルギー効率を測定しました。各構成は、その戦略に適切なパラメーターを使用して、上記の反応拡散モデルを使用してシミュレートされました (補足図 26)。

これらの構成間で考えられるすべてのエンジニアリングパスを見つけるために、考えられる各構成がノードとなるグラフを検討しました。ノードが 1 つのエンジニアリングステップによって分離されている場合、ノードは無向エッジによって接続されていると見なされます。したがって、グラフ上でステップを実行することにより、PCCM パフォーマンスが低い開始ノードとパフォーマンスが良好なターゲットノードを考慮して、考えられるすべてのエンジニアリングパスを検索しました。単一のエンジニアリングステップには、酵素、チャネル、拡散バリアの追加または除去、および単一の酵素の局在化が含まれる可能性があります。例外はルビスコの局在化であり、相分離した凝縮物を形成するため、LCIB がマトリックスから除外される可能性があると考えられました 26。我々は、デンプン鞘とチラコイドスタックの両方を拡散障壁として利用する戦略を考慮しなかった。 MATLAB (R2020a) のカスタム深さ優先検索アルゴリズムを使用して、開始ノードとターゲットノード間のすべての最短エンジニアリングパスを特定しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この記事と補足の表に含まれています。生のデータセットは、Zenodo リポジトリ (https://doi.org/10.5281/zenodo.6406849) に保管されています。

カスタムシミュレーションコードは、GitHub (https://github.com/f-chenyi/Chlamydomonas-CCM) で入手できます。

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洞察力に富んだ議論をしてくださった Jonikas グループと Wingreen グループのメンバーに感謝します。この研究は、助成金 5R01GM140032-02 (NSW および MCJ) を通じて国立衛生研究所によって支援されました。助成金 MCB-1935444 (MCJ) および生物機能物理センター PHY-1734030 (NSW) を通じて国立科学財団。シモンズ財団とハワード・ヒューズ医学研究所の助成金 55108535 (MCJ)。 MCJ はハワード・ヒューズ医学研究所の研究員です。図のサブセットの回路図は BioRender.com で作成されました。

Chenyi Fei、Alexandra T. Wilson などの著者も同様に貢献しました。

プリンストン大学分子生物学部、プリンストン、ニュージャージー州、米国

チェンイー・フェイ、アレクサンドラ・T・ウィルソン、ネッド・S・ウィングリーン、マーティン・C・ジョニカス

ルイス・シグラー統合ゲノミクス研究所、プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州、米国

チェンイー・フェイ & ネッド・S・ウィングリーン

マサチューセッツ工科大学生物学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

アレクサンドラ・T・ウィルソン

米国イリノイ州エバンストン、ノースウェスタン大学工学科学および応用数学学部

ナイル・M・マンガン

ハワード・ヒューズ医学研究所、プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州、米国

マーティン・C・ジョニカス

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CF、ATW、NMM、NSW、MCJ が計画した研究。 CF、ATW、NMM、NSW がモデリングを実行しました。 CF と ATW はシミュレーションを実行しました。 CF、ATW、NMM、NSW、MCJ の分析データ。 CF、ATW、NMM、NSW、MCJ が原稿を執筆しました。

ナイル・M・マンガン、ネッド・S・ウィングリーン、マーティン・C・ジョニカスとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Plants は、この研究の査読に貢献してくれた松田祐介氏と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足 I ～ VI、図。 1 ～ 31 および表 1 ～ 4。

補足表 5 および 6。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

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フェイ、C.、ウィルソン、AT、マンガン、ニューメキシコ他ピレノイドベースの CO2 濃縮メカニズムをモデル化することで、その動作原理についての洞察と、作物へのエンジニアリングのロードマップが得られます。ナット。 Plants 8、583–595 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41477-022-01153-7

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受信日: 2021 年 8 月 4 日

受理日: 2022 年 4 月 11 日

公開日: 2022 年 5 月 19 日

発行日：2022年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01153-7

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