一次および二次聴覚皮質における独特の非線形分光時間統合

Aug 28, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7658 (2023) この記事を引用

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動物は階層的な神経経路を通じて音を感知し、最終的には高次の皮質に到達して、発声などの複雑な音響特徴を抽出します。 分光時間統合が一次聴覚皮質から高次聴覚皮質までの階層に沿ってどのように変化するかを解明することは、この精緻な感覚計算を理解する上で重要なステップです。 今回我々は、二光子カルシウムイメージングとさまざまな周波数とタイミングの組み合わせによる二音刺激を用いて、マウスの一次聴覚野（A1）と二次聴覚野（A2）の間の分光時間的統合を比較した。 個々のニューロンは、周波数とタイミングの組み合わせに特有の方法で、超線形および準線形の混合統合を示し、これら 2 つの領域で独自の統合パターンが見出されました。 A1ニューロンにおける時間的に非対称な分光時間統合は、周波数変調された掃引方向の識別におけるそれらの役割を示唆した。 対照的に、A2 ニューロンは時間的に対称で同時発生を優先する統合により、同時に発生する多周波数音の理想的なスペクトル統合器となりました。 さらに、A2 のアンサンブル神経活動は 2 音のタイミングに敏感であり、2 つの音が同時に発生すると、成分音の線形和から異なるアンサンブル活動パターンが引き起こされました。 これらの結果を総合すると、複雑な音響特徴のエンコードにおける A1 と A2 の異なる役割が実証され、これらの領域間の情報抽出が逐次ではなく並行して行われる可能性があることが示唆されます。

私たちの脳は、感覚空間と時間の両方にわたる入力を統合して、外界の物体を認識します。 視覚における移動エッジ 1 や体性感覚におけるひげの偏向シーケンス 2、3、4 に反応するニューロンなど、時空間シーケンスに敏感なニューロンは、感覚皮質における物体認識の基本的な構成要素と考えられています。 一次聴覚野では、特定のスペクトルと時間の組み合わせを持つ 2 音シーケンスは、個々の純音によって引き起こされる反応と比較して、超線形 5、6、7 またはサブリニア 8、9、10、11 の反応を引き起こす可能性があります。 この非線形統合は、高次皮質における周波数変調 (FM) スイープ、音声シーケンス、最終的には種固有の発声など、より複雑な音響特徴の抽出の根底にあると考えられます。 したがって、2音の分光時間結合選択性が一次聴覚皮質から高次聴覚皮質までどのように変化するかを理解することは、皮質階層に沿った音情報の逐次変換を解明する上で重要なステップとなります。

哺乳類の一次聴覚野は純音周波数への鋭い同調を特徴としていますが、二音刺激を用いた研究により、皮質計算のこの初期段階で広範な非線形統合が行われていることが明らかになりました。 何十年もの間、ツートーン応答は、遅れたトーンに対する先行するトーンの抑制的な影響 (「フォワード マスキング」) が最もよく知られてきました。 より具体的には、ニューロンの受容野の外側のトーンによって引き起こされる抑制は「側波帯抑制」または「側波帯抑制」として知られており、FM 掃引方向の選択性を形成する上で重要な役割を果たしています9,12,13,14,15。 一方、それほど広範囲には調査されていないが、2 つの音の促進的な統合がさまざまな種で観察されており 5、6、7、これはより複雑な音響特徴の抽出の基礎となる要素の「特徴検出器」として機能する可能性がある。 重要なのは、特定の 2 音の組み合わせに応じて、同じニューロンが促進性統合と抑制性統合の両方を示すことができ、2 音刺激空間 (周波数と時間の次元に沿って定義され、以下「分光時間的相互作用マップ」と呼びます) 内でのそれらの分布がそれぞれの特徴を特徴付けることです。ニューロンのユニークな音声統合能力。 同じ記録領域内であっても、2 トーンの組み合わせに特有の統合パターンにおいて、個々のニューロン間には不均一性が存在します。 したがって、個々の皮質領域の音声統合能力を理解するには、大規模なニューロン集団レベルでの分光時空間相互作用マップの詳細な定量化が必要です。

高次聴覚皮質では、ニューロンは種特有の発声 16、17、18、19 や人間の言語 20、21、22 などの複雑な感覚刺激に強く反応することがよくあります。 我々は最近、マウスの二次聴覚野（A2）のニューロンが、非同期開始よりも同期開始の倍音スタックに優先的に反応することを報告しました17。 この発見は、A2 における特殊な分光時間統合を示しましたが、以前の研究では刺激ごとに最大 20 の周波数成分を使用していたため、この領域の詳細な分光時間相互作用パターンを決定することができませんでした。 本研究では、集団ニューロン活動の二光子カルシウムイメージングを使用して、ツートーンパラダイムを使用して、A1とA2の間の非線形分光時間相互作用マップを比較しました。 我々は、これら 2 つの領域が、ツートーン刺激空間の周波数および時間次元に沿って促進的相互作用と抑制的相互作用の異なる分布を示すことを発見しました。 具体的には、A1 ニューロンは、FM 方向の識別と一致して、時間的に非対称な分光時空間相互作用マップを示しましたが、A2 ニューロンでは対称的で同時発生を優先した統合により、同時に発生する音のスペクトル統合器となります。 したがって、我々の結果は、分光時間統合における A1 と A2 の間の機能の明確な分割を示しており、物体認識と知覚行動に対するそれらの明確な寄与を示唆しています。

個々のニューロンにおけるスペクトル次元と時間次元の両方に沿った音の統合を調べるために、目を覚まして頭を固定したマウスの二光子カルシウムイメージングを使用して、二音刺激に対するニューロンの反応を測定しました（図1a）。 GCaMP6s 発現アデノ随伴ウイルス (AAV) の注射とガラス窓移植の 2 ～ 3 週間後、ガラス窓を通した固有シグナル イメージングによってトノトピック マップが特定されました (「方法」を参照) 23。 私たちは視野を A1 または A2 に設定し、超線形相互作用がより深い粒状層よりも頻繁に発生することが報告されている層 2/3 (L2/3) を画像化しました。 私たちの視野はA2のサイズよりも大きかったため、2光子画像は固有の信号マップと比較され、機能的に定義された領域の境界内のニューロンのみが分析に含まれました（「方法」を参照）。 合計で、1234 個の A1 ニューロン (9 匹のマウス、12 視野) と 435 個の A2 ニューロン (7 匹のマウス) から記録しました。 分光時間的相互作用は、視野内のニューロン集団の最良の周波数に固定された1つのトーン（「中心音」）を持つ70 dB SPLの2トーン刺激を提示することによって決定されました（図1b）。 もう 1 つの音 (「dF 音」) は 9 つの周波数 (dF: 中心音を中心に - 1 ～ + 1 オクターブ、0.25 オクターブ間隔) から選択されました。 各トーン ピップの持続時間は 20 ミリ秒で、オンセットからオンセットまでのタイミングは 9 つの間隔 (dT: − 100 ～ + 100 ミリ秒、25 ミリ秒間隔) から選択されました。これにより、dT = 0 を除いて 2 つのトーン間で時間的な重複がなくなりました。負の値は主要な dF トーンを示します)。 コンポーネントトーンも個別に表示され、合計における線形性の計算が可能になりました。 dF と dT の範囲は、マウスの発声における周波数変調の行動学的範囲 (< 40 oct/sec) に一致するように選択されました 12。 具体的には、dT = 100 ms、dF = 0.25 oct は 2.5 oct/sec に相当し、dT = 25 ms、dF = 1 oct は 40 oct/sec に相当します。 画像化されたすべてのニューロンのうち、65.0 ± 3.4% (A1) と 76.5 ± 5.4% (A2) が少なくとも 1 つの音に反応しました。 図1cは、A1およびA2の代表的なニューロンのツートーンおよびシングルトーン応答トレースを示しています。 これらのニューロンは、個々のトーンには弱く反応しましたが、特定の周波数とタイミングの組み合わせを持つ 2 つのトーンに対しては強い反応を示しました。 各 dF-dT ペアの線形性指数 (LI) を計算することにより、超線形および準線形積分の分布をマッピングしました (図 1d)。 LI は (T − L)/(T + L) として計算されました。ここで、T は 2 トーン刺激に対する応答を表し、L は個々のトーンに対する応答の線形合計を表します。 したがって、LI の範囲は - 1 から 1 であり、負の値は準線形性を表し、正の値は超線形性を表し、0 は線形加算を表します。 代表的なニューロン1および2の結果として得られた分光時間相互作用マップは、独特のパターンで超線形性とサブ線形性が混在していることを示しました（図1e）。 A1 のニューロン 1 は、dT < 0、dF < 0 象限におけるクラスター超線形性を除いて、全体的な準線形性を示しました。 A2 のニューロン 2 は、dT = 0 で強い超線形性を示しました (一致、赤い矢印)。一方、同じ周波数ペアでは、dT = 25 ms の隣接する列でも、シフトされたタイミングでサブリニアの合計が発生しました (青い矢印、線形と重なったトレース)。図1dの合計）。 これらの分光時間的相互作用マップは、ニューロン 1 とニューロン 2 が異なる感覚特徴、つまりそれぞれ上向きの周波数ステップと一致する多周波数スタックを抽出していることを示唆しています。

ツートーン刺激を使用した分光時間的相互作用の定量化。 (a) 2 光子イメージングのセットアップ。 聴覚野は最初に固有信号イメージングによってマッピングされ、慢性的な窓埋め込みをガイドするために使用されました。 左下、頭蓋骨を通して画像化された皮質血管系に重ねられた純音に対する閾値処理された固有信号応答。 右下、A1 の L2/3 ニューロンの in vivo 二光子画像。 (b) 2 つの 20 ms トーンそれぞれの周波数と時間の関係を示す音刺激の概略図。 中心音は、視野内のニューロン集団の最適な周波数に一致しました。 (c) 代表的な A1 (上) および A2 (下) ニューロンにおける各 dF-dT ペアおよび単一トーン提示に対する応答。 トレースは 5 回のトライアルの平均です。 挿入図は、提示された 2 つのトーン間の分光時間的関係を示しています。 (d) (c) の矢印でマークされたニューロン反応の LI の計算。 LI > 0 (赤い矢印) は、両方の周波数成分の線形和と比較した 2 つのトーンの超線形積分を示し、LI < 0 (青い矢印) はサブ線形積分を示します。 （ e ）ニューロン1（A1）およびニューロン2（A2）のdF-dTペアにわたるLIを示す分光時間相互作用マップ。

図2は、A1（図2a〜c）およびA2（図2d〜f）で画像化した代表的な動物の分光時空間相互作用マップを示しています。 一般に、分光時間相互作用マップでは、個々のニューロン内でも超線形相互作用とサブ線形相互作用が混在していることが明らかになりました。 これらのパターンは、緊張非反応性ニューロンに焦点を当てて主に促進的な相互作用を報告したマーモセットの以前の研究のものよりも複雑でした5（「考察」を参照）（図2b）。 同じ視野内であっても、分光時間相互作用マップは個々のニューロン間で大幅に異なりました。 たとえば、ニューロン 1 (A1、図 1c 上と同じニューロン) は 1 つの象限でクラスター化された超線形性を示しましたが、ニューロン 3 は、dT = 0 列の周囲のサブ線形性のクラスターを除いて、全体的な超線形性を示しました。 純音応答のないニューロンでは、サブリニアリティは観察されずに、特定の dF-dT の組み合わせで超線形加算が観察されました (ニューロン 4)。 このマウスのすべてのA1ニューロンからの分光時間的相互作用マップを平均したところ、集団マップは超線形性に囲まれた中心での準線形性（dTは-50〜+ 50ms、dFは-1〜+ 0.5 oct）を示しました（図2c）。 。 対照的に、A2 では、一致 (dT = 0 ms) 列に沿って 2 つのトーンを超線形に統合した多くのニューロンが観察されました (ニューロン 2: 図 1c 下と同じニューロン)。 純音応答のないニューロンでは、多くの場合、dT = 0 (ニューロン 5) に沿ってのみ純粋な超線形性が見つかりました。 重要なことに、dT = 0、dF = 0 では超線形性が観察されませんでした (同じ周波数の位相でトーンが完全に重なり、76 dB SPL で単一のトーンが得られます)。これは、これらの A2 ニューロンにおける超線形統合には多周波数音が必要であることを示しています。 A1 と A2 の両方で、全体的に準線形性を持つニューロン (ニューロン 6) も見つかりました。 このマウスのすべての A2 ニューロンからの分光時間的相互作用マップを平均すると、dT = 0 列に沿った超線形性が明らかであり、A1 ニューロンと A2 ニューロンの間の明確な分光時間的統合が示唆されました。

代表的なマウスの A1 細胞と A2 細胞の分光時間的相互作用マップ。 (a) 代表的なマウスのガラス窓を通して画像化された皮質血管系に重ねられた固有信号画像。 黄色の四角は、A1 の 2 光子イメージングの視野を表します。 (b) 分光時間的相互作用マップ、たとえば (a) と同じマウスの A1 ニューロンは、dF-dT ペアにわたる超線形相互作用とサブ線形相互作用が混在していることを示しています。 (c) 同じマウスのすべての A1 ニューロンにわたる平均分光時間的相互作用マップ。 n = 121 ニューロン。 (d) A2 2 光子イメージングによる代表的なマウスの内因性シグナル画像。 (e) (b) と同じですが、たとえば A2 のニューロンです。 (f) (c) と同じですが、(d) および (e) と同じマウスの A2 ニューロン全体です。 n = 35 ニューロン。

図 3 は、809 (A1) および 322 (A2) の音応答ニューロンに基づく集団分析を示しています。 個々のニューロン間の応答特性が不均一であるにもかかわらず、集団の分光時間的相互作用マップにより、A1 と A2 の固有のパターンが明らかになりました。 A2 マップの最も顕著な特徴は、一致しない dT の広い準線形性に対する、一致する音の超線形合計との間の鮮明なコントラストです (図 3a)。 対照的に、A1 では、分光時間マップのパターンはあまり明確ではなく、超線形性が dT 全体に分布していました。 A1 ニューロンと A2 ニューロンの間の分光時間的統合の違いは、純音応答特性によって説明されませんでした（補足図 1）。 正規化された応答の大きさと dT 軸に沿った直線性指数の両方は、2 つのトーンを一致させるための A2 ニューロンの鋭い調整を示しています (図 3b)。 純音非反応性ニューロンのみを分析した場合でも、結果は同じでした（補足図2）。 この一致選好は、我々が以前に報告した一致する高調波スタック (3 ～ 20 の周波数成分) に対する A2 ニューロンの優先応答を説明しています 17 (「考察」を参照)。 A1集団の活動における線形に近い全体の合計（図3b）は、個々のニューロンの超線形性または準線形性の欠如を反映していないことに注意することが重要です。 統計的に有意な超線形性を持つニューロンの割合が各dF-dTペアについて計算された場合、A2ニューロンのより一致特異的な超線形性と比較して、A1は超線形性の広い分布を示しました（図3c、d;「促進」）。 対照的に、A2では統計的に有意なサブリニアリティがより広範囲に観察されましたが、A1は中心付近でより制限されたサブリニアリティを示しました（図3c、d;「抑制」）。 それにもかかわらず、dF と dT にわたる促進的相互作用と抑制的相互作用の分布は A1 でよりバランスが取れており、その結果、集団レベルで明らかに線形に近い合計が得られました。 A2 では、制限された促進と広範囲に分散した抑制の組み合わせにより、全体的に準線形性が生じ、dT = 0 で超線形性の鋭いピークが生じます。

A1 ニューロンと A2 ニューロンは、異なる分光時間的組み合わせを持つ 2 音刺激を統合します。 (a) すべての A1 および A2 細胞にわたる分光時間統合マップ。 A1、n = 9 マウス、809 個の応答細胞。 A2、n = 7 マウス、322 個の応答細胞。 (b) 左、A1 と A2 の正規化された応答の大きさを比較した要約データ。 右は、A1 と A2 の直線性指数を比較した要約データです。 A1: n = 2596 セル-dF ペア、A2: n = 1498 セル-dF ペア。 データは平均値 ± SEM です。 (c) A1 の各 dF-dT ペアについて、統計的に有意な超線形性 (促進的相互作用) および副線形性 (抑制的相互作用) を持つニューロンの割合。 (d) (c) と同じですが、A2 の場合です。 (e) ツートーンタイミングの好みによって分類された A1 および A2 ニューロン。 シフトされた刺激よりも同時を好むニューロンの割合は、A1 よりも A2 で有意に高かった（カイ二乗検定、p < 1.00 × 10–16）。 (f) A1 と A2 のすべての音応答セルの非対称指数の累積確率プロット。 ***p = 2.65 × 10–8、ウィルコクソン順位和検定。

次に、ツートーンタイミングの好みに基づいてニューロンを分類しました。 シフトされた刺激よりも同時を好むニューロンの割合は、A1よりもA2で有意に高かった（A1：29.3％、A2：57.8％、カイ二乗検定、p < 1.00×10-16）（図3e）。 シフトされた刺激優先ニューロンは、負の dT 優先ニューロン、正の dT 優先ニューロン、および対称ニューロンにさらに細分することができます。 片側を優先するニューロンの割合は A2 でははるかに小さく、個々のニューロンの分光時間的相互作用マップの対称性が高いことを示唆しています。 これをテストするために、個々のニューロンの非対称指数を |(P – N)/(P + N)| として計算しました。ここで、P と N は、それぞれ正と負の dT を持つツートーン刺激に対する応答を表します。 非対称指数は、A1ニューロンよりもA2ニューロンで有意に低いことがわかりました（ウィルコクソン順位和検定、p = 2.65×10–8）（図3f）。 総合すると、これらの結果は、A1 と A2 で異なる音声情報が抽出されたことを示唆しています。 A1 ニューロンは時間の経過に伴う音の周波数の変化をよりよく抽出しますが、A2 ニューロンは同時に提示された複数の周波数を統合する準備ができています。

個々のニューロンの分光時間相互作用マップで観察された非対称性は、音に存在する周波数変調の抽出を予測できる可能性があります。 ツートーンの分光時間的相互作用と FM チューニングの関係を直接調べるために、実験のサブセット (A1: n = 6 匹のマウス、9 つの視野、993 個の細胞; A2: n = 6 匹のマウス、361 個の細胞) (図 4a)。 FM チューニング特性は、マウスの発声で使用されるレートに近い上向きまたは下向きのスイープを提示することによって決定されました (2.5 ～ 80 oct/秒、各方向に 6 レート)12。 幅広い周波数設定でニューロンの反応を引き起こすために、4 オクターブ範囲 (4 ～ 64 kHz) の長い FM スイープを 70 dB SPL で提示しました。 画像化されたすべてのニューロンのうち、39.8% (A1) と 62.0% (A2) が、少なくとも 1 つのスイープ刺激に対して顕著な興奮性反応を示しました。 私たちの以前の研究12と一致して、A1の応答ニューロンの割合は遅いFM掃引から速いFM掃引まで単調に減少しました。これは、おそらく遅い（したがってより長い持続時間）掃引によって送信されるより大きな音響エネルギーを反映していると考えられます（図4b）。 対照的に、A2 はすべての FM レートで A1 よりも反応性ニューロンの割合が大きいことを示しました (多重比較のためのボンフェローニ補正を使用したカイ 2 乗検定、p < 0.001) が、その差はより速い FM レートで特に明白でした。 A2 における高速 FM のこの優先エンコードは、これらの音がより多くのほぼ一致した周波数成分を含んでおり、A2 ニューロンによって超線形に統合されるためである可能性があります。 個々のニューロンの方向選択性指数 (DSI) を (U − D)/(U + D) として計算しました。ここで、U と D はそれぞれ上向きスイープと下向きスイープによって引き起こされる応答を表します。 興味深いことに、中間の FM レート付近では、A2 は A1 よりも大幅に低い絶対 DSI を示しました (10 oct/秒 A1: 0.56 ± 0.03、A2: 0.41 ± 0.03、p = 2.5 × 10–3; 20 oct/秒 A1: 0.59 ± 0.03、 A2: 0.40 ± 0.03、p = 1.5 × 10–5; 多重比較のためのボンフェローニ補正を使用したウィルコクソン順位和検定) (図 4c)。 この結果は、A1 エリアと A2 エリアの間で DSI に差がないと報告した以前の研究とは対照的でした 24 が、この不一致は、非常に広範囲の FM レート (8 ～ 670 oct/秒) を組み合わせた DSI 計算によるものと考えられます。

抑制的な分光時間的相互作用における非対称性は、FM 方向の選択性と相関しています。 (a) 上部、A1 の代表的な L2/3 錐体細胞の FM スイープ調整。 トレースは 5 回の試験にわたる平均応答です。 下部の挿入図は、周波数対時間の表現の概略図を示しています。 下は、同じニューロンの 2 トーンの分光時間相互作用マップです。 黄色のボックス: 上向きの領域、青のボックス: 下向きの領域。 (b) A1 および A2 における 6 つの絶対 FM 速度での応答細胞の割合。 A1: n = 6 マウス、993 細胞。 A2: n = 6 マウス、361 細胞。 すべての速度で ***p < 0.001、ボンフェローニ補正によるカイ二乗検定。 (c) A1 と A2 の各 FM レートにおける絶対 DSI の平均 (実線) と SEM (シェーディング)。 A1: 391 個のスイープ応答セル。 A2: n = 222 のスイープ応答セル。 **p < 0.01。 （ d ）上、10〜40 oct/秒で平均された錐体細胞のDSIは、抑制的相互作用（Biassupp）の直線性指数バイアスと強い相関がありますが、促進的相互作用（Biasfac）とは相関しません。 p = 0.0006、両側 t 検定。 赤い線、回帰曲線。 n = 220 セルは FM スイープと 2 つのトーンの両方に応答します。 DSI と線形性インデックス バイアスの間の相関関係の下部、p、および R 値を FM レートで区切ったもの。 *p < 0.05。 p 値は、ボンフェローニ補正による多重比較のために調整されます。 (e) (d) と同じですが、A2 の場合です。 n = 171 セルは FM スイープと 2 つのトーンの両方に応答します。

A1 ニューロンと A2 ニューロンの間の FM スイープ応答特性の違いを観察したので、分光時間相互作用マップの特定の特徴がこれらの違いを説明するかどうかを調べました。 私たちの以前の研究の理論的および実験的データは、皮質側方抑制が中速範囲（10〜40 oct/秒）内でA1のFM方向選択性に寄与するが、低速または高速ではその程度が小さいことを示しました12。 したがって、我々は、側方抑制を反映する抑制的な分光時間的相互作用の非対称性が、A1 におけるより高い FM 方向選択性の原因である可能性があると仮説を立てました。 この仮説を検証するために、非線形計算タイプ、促進的 (超線形) または抑制的 (サブリニア) の分光時間的相互作用のどちらが FM 方向選択性と相関を示すかを尋ねました。 画像化されたすべてのニューロンのうち、220 (A1) と 171 (A2) のニューロンが、ツートーン刺激と FM スイープ刺激の両方に対して有意な応答を示しました。 理論的には、分光時間相互作用マップは、FM 方向選択性への潜在的な寄与に基づいて 2 つの領域に分割できます (図 4a)。 dF > 0、dT > 0、および dF < 0、dT < 0 象限 (「上向き領域」: 図 4a の黄色のボックス) の超線形性は、上向き FM 方向選択性を予測しますが、dF < 0、dT > 0、および dF > 0 、dT < 0 象限 (「下向き領域」: 青いボックス) は、下向きの FM 方向の選択性を示唆しています。 対照的に、同じ領域内のサブ線形性は、反対方向の選択性を予測します。 個々のニューロンにおいて、促進的相互作用 (LI > 0) と抑制的相互作用 (LI < 0) について、上向き領域と下向き領域内の LI の合計を個別に計算しました。 上向き領域と下向き領域の間の非対称性を定量化するために、促進的相互作用と抑制的相互作用 (Biasfac と Biassupp) の「線形性インデックス バイアス」を、上向き領域と下向き領域間の合計 LI の差として定義しました (「方法」を参照)。 個々の A1 ニューロンの DSI と線形性インデックスのバイアス値を比較すると、DSI と Biassupp の間に強い相関関係があることがわかりました (図 4d)。 重要なことに、相関は中程度のFM速度でより強く、20および40 oct/秒のFM速度で統計的に有意であり、方向選択性への阻害寄与の理論的予測と一致しています12（図4dおよび補足図3）。 A2では、20 oct/秒でDSIとBiassuppの間に有意な相関関係が観察されましたが、全体的な相関関係はA1よりも弱かった（図4e）。 したがって、A1 ニューロンの強い方向選択性は、抑制的な分時時相互作用マップの非対称性によって少なくとも部分的に説明されますが、より対称的な A2 分時時相互作用は、この領域で弱い方向選択性の応答をもたらします。 DSI と Biassupp の間の強い相関とは対照的に、FM 速度や皮質領域に関係なく、DSI と Biasfac の間に有意な相関は見つかりませんでした (「考察」を参照)。 したがって、我々の結果は、マウスの行動学的FM速度での方向選択性の形成における皮質抑制の役割と一致しています。

最後に、大規模な母集団データを利用して、ニューロン集団の活動パターンがシングルトーン表現とツートーン表現の間でどのように非線形に変化するかを定量化しました。 マーモセット A1 に関する以前の研究と一致して、我々は、2 音の刺激に対しては有意な反応を示したが、個々の音には反応しなかった多くのニューロンを発見しました。 シングルトーン非応答性ニューロンのうち、53.0% (A1) と 55.2% (A2) が、一致またはシフトした 2 つのトーンに応答しました (図 5a)。 したがって、ツートーン刺激は、シングルトーンで募集されたアンサンブルの線形和とは異なるニューロンのアンサンブルを募集します。 これを定量化するために、2 トーンの個々のトーン (「シングルトーン」) と個々のトーンの線形和 (「線形和」) の高次元空間におけるアンサンブル ニューロン活動ベクトル間の相関係数を計算しました (図.5b）。 A1とA2の両方で、ツートーン表現はシングルトーンよりも線形和との全体的に高い相関を示し、ツートーンアンサンブル応答パターンが両方の成分トーンの表現を反映していることを示しています（図5c）。 しかし、一致したトーンと時間的にシフトしたトーンを分離すると、A1 と A2 の間には明らかな違いがありました。 A1 と A2 の両方で、線形和は、シフトされた 2 トーン刺激よりも一致した場合の相関係数が低いことを示しました (A1 一致: 0.62 ± 0.05、シフト: 0.73 ± 0.01、p = 0.0124; A2 一致: 0.40 ± 0.07、シフト: 0.81 ± 0.01、p = 3.77×10–9）、この差はA2ではるかに顕著でした（A1の一致とA2の一致、p = 6.24×10–5）（図5c、d）。 これらの結果は、A2 ニューロンアンサンブルが、その構成音と比較して同時発生音に対して異なる活動パターンを示すことを示しており、時間的にコヒーレントな音の知覚的結合に A2 ニューロンアンサンブルが寄与している可能性があることを示唆しています 17,25,26,27。 興味深いことに、線形和と時間的にシフトした 2 つのトーンの間の相関係数は、A1 よりも A2 の方が有意に高かった (p = 6.57 × 10–6)。 したがって、トーンが非同期の場合、A1 アンサンブルはコンポーネント トーンの表現を統合して非線形に変換しますが、A2 アンサンブルはコンポーネント トーンをより正確にエンコードします。 これらの人口レベルの分析を総合すると、2 つの地域間の健全な統合機能の分割が実証されています。 A1 は時間的にずれた音を優先的に統合して変換しますが、A2 は同時発生する音を選択的に非線形統合します。

アンサンブル活動パターンは、A1 と A2 の間の異なる統合関数を示します。 (a) L2/3 のシングルトーン非応答ニューロンのうち、53.0% (A1) と 55.2% (A2) が、一致するトーンまたは 8 つのシフトされた 2 トーンの少なくとも 1 つに応答しました。 (b) 2 つのトーン、個々のトーン (「Tonecent」および「TonedF」)、および個々のトーンの線形和 (「線形和」) の高次元空間におけるアンサンブル ニューロン活動ベクトルを示す概略図。 (c) A1 (左) と A2 (右) の dT にわたるシングルトーンと 2 トーン (黒線) の表現の間、および線形和と 2 トーン (赤の線) 表現の間の相関係数。 実線：平均、陰影：SEM。 (d) 同時およびシフトされた 2 トーン刺激について、2 トーン表現と線形和表現の間の相関係数を個別に示す箱ひげ図。 ボックス: 25 ～ 75 パーセンタイル。 ひげ: カバー率 99.3%。 赤い線: 中央値。 青い十字: 外れ値。 シフト: n = 64 dF-dT ペア、一致: n = 8 dF-dT ペア。 *p < 0.05、***p < 0.001、二元配置分散分析とそれに続く Tukey の正直な有意性検定。

この研究では、機能的に同定された皮質領域からのツートーン応答を定量化し、細胞活動レベルとアンサンブル活動レベルの両方でA1とA2の間の明確な分光時間的相互作用規則を発見しました。 私たちの結果は、分光時間統合における機能の領域分割を示しています。A1 ニューロンはトーンの時間シーケンスを優先的に統合するため、周波数変調の方向をエンコードする準備ができています。 対照的に、A2 ニューロンにおける時間的に対称で同時発生を優先する 2 トーン相互作用により、同時発生トーンのスペクトル統合が可能になります。 私たちの分光時間相互作用マップにより、個々のニューロン内でも超線形相互作用とサブ線形相互作用が混在していることが明らかになったということは、強調する価値があります (図 1 および 2)。 これらのマップは、ほぼ純粋に促進的な相互作用を視覚化したマーモセット A1 の以前の研究のものよりも複雑でした 5。 統合における種依存の可能性を排除することはできませんが、この違いは、以前の研究が純音非応答性ニューロンに焦点を当てて分析を行ったため、定義によりサブリニア応答の可視化が制限されていたためである可能性が最も高くなります。 超線形相互作用と準線形相互作用の混合分布は、優先音シーケンスと非優先音シーケンスに対する神経応答間のコントラストを強化し、それによって個々のニューロンの情報符号化効率を向上させるはずです。

A2 では、時間的にシフトした 2 つのトーンよりも一致を表現することを強く好むことがわかりました。 さらに、一致しているがずれていない 2 つの音のアンサンブル活動は、個々の音の線形和とは異なるパターンを示し、時間的にコヒーレントな音の知覚的結合に潜在的に寄与している 25、26、27。 このユニークな多周波数積分特性は、A2 ニューロンにおける一致する高調波の優先的表現の基礎を形成している可能性があります 17。 ただし、3 ～ 20 の高調波成分を含む刺激を使用した以前の研究とはいくつかの違いがあることに気づきました。 まず、A2 での同時ツートーン積分の明確な超線形性を観察しました (図 3b)。これは、多周波数高調波を使用して以前に報告した全体的な準線形性とは対照的です。 神経回路に広く普及している正規化メカニズム 28 を考慮すると、以前の研究で使用された多数の音声コンポーネントにより、神経活動の上限によりよりサブリニアな相互作用が引き起こされた可能性があります。 第二に、A1ニューロンは、小さな時間的シフトを伴う刺激よりも、一致するトーンを好むことがわかりました（図3b）。これは、集団レベルでの以前の実験では見られませんでした。 我々は以前に 10 音調波スタックを備えた A1 で偶然を好むニューロンの一部を発見したため、これらの結果は矛盾しません。 最も可能性が高いのは、A1 でも同時発生するサウンドの統合が弱く、サウンドのコンポーネントの数が増加するにつれて超線形性が低下することです。 この同時音の統合は、A1 ニューロンに固有のものであるか、トップダウン入力を通じて A2 から伝達される可能性があります 29。 それにもかかわらず、アンサンブル活動パターンの劇的な変化はA2でのみ見つかり、A1では見られませんでした（図5d）。これは、これらの領域間の明確な統合の役割を示唆しています。 これらを総合すると、本研究では最小限の複雑さの 2 トーン刺激を使用することで、個々のニューロンにおけるトーンシーケンスのよりダイナミックな表現が明らかになり、特定の周波数間隔の組み合わせに応じて超線形相互作用とサブ線形相互作用の両方を示します。

カルシウムイメージング実験の結果を解釈する際には 2 つの制限があることに注意してください。 まず、GCaMP カルシウム イメージングは​​集団レベルの音応答特性を調査するための優れた統計力を提供しましたが、GCaMP の反応速度が遅いため、神経応答によって伝えられた可能性のある細かい時間情報を分析することができませんでした。 A2を対象とした将来の電気生理学的記録により、ツートーン応答のより詳細な動態が明らかになり、その分光時間統合の根底にある回路機構についての洞察が得られる可能性がある。 第 2 に、GCaMP カルシウム イメージングは​​神経活動の間接的な測定であり、発火率が高いニューロンのスパイク数を読み出す際に線形性が損なわれる可能性があります。 したがって、私たちのデータは、分光時間統合における超線形性よりもサブ線形性を観察することに偏っている可能性があります。 それにもかかわらず、私たちの観察は過小評価である可能性が高いため、このバイアスは、A2 での同時発生音の超線形統合についての結論をさらに強化します。

我々は、FM方向選択性がツートーン応答における抑制的相互作用とは相関するが、促進的相互作用とは相関しないことを実証した。 この結果は、皮質抑制が側方抑制を通じて A1 FM 方向選択性を形成するという考えと一致しています 9,12,13,14,15。 我々の以前の回路モデルは、阻害が中域のFMレート（10〜40 oct/s）での方向選択性を形成すると予測しており、現在の実験データはこのモデルを裏付けています（図4d）。 さらに、A2の対称的な分光時間相互作用マップは、この領域で観察された下方向の選択性を説明しています（図3fおよび4c）。 A1 の方向選択性を生み出す非対称阻害は、低周波応答領域と高周波応答領域の空間的分離に起因します 12,30。 A2 では、圧縮され分離が不十分なトノトピー 31、32、33、34、35、36 により、抑制の非対称性が低下し、したがって方向選択性を生成できません。

私たちの結果は、コウモリ 6 およびマーモセット 5 の FM 方向選択性における促進的な 2 音相互作用の役割を提案した以前の研究と矛盾しているように見えるかもしれません。 この不一致は、研究間でテストされた刺激空間の違いによるものである可能性があり、テストしたものよりも高い FM 速度での方向選択性を促進的相互作用が説明できる可能性を排除しません。 現在の研究では、2.5 ～ 40 オクターブ/秒の遷移に相当する、0.25 ～ 1 オクターブ分離で 25 ～ 100 ミリ秒の間隔で 2 音の時間的相互作用を調査しました。 対照的に、以前の研究では、促進的相互作用は主に短い間隔 (< 10 ms6 または < 25 ms5) で観察されていましたが、この研究ではテストしませんでした。 これまでの研究の多くは、コウモリのエコーロケーション（> 100 oct/sec）における高速 FM を模倣した、短時間の時間的相互作用に焦点を当てていました。 しかし、他の種の音声コミュニケーションには通常、はるかに遅い FM が含まれており、マウスの発声は 40 oct/sec 未満の FM によって支配されることが以前に示されました 12。 我々の結果は、遅い抑制性ネットワークダイナミクス12、30、37、38、39が、マウスにおける動物行動学的に関連する遅いFM速度の表現を調節するのに適していることを示唆している。 この考えは、複数の非反響定位種における音の統合について観察された長い時間枠（最大数百ミリ秒）と一致しています40、41、42。 もちろん、マウスにおいても、促進性興奮機構がより高速な FM スイープのエンコードに寄与している可能性があります。 複数のメカニズムが存在することで、神経回路がさまざまな刺激パラメータで FM 方向をエンコードできる可能性があります。 最後に、FM 掃引速度は、以前の研究で A1 と A2 の間で観察された FM 方向選択性の違いの欠如の原因にもなる可能性があることに注意します 24。 この以前の論文は8〜670 oct/秒のスイープの結果を組み合わせたものであるため、中速度範囲で観察されたA2ニューロンの下方向選択性（図4c）は、その結果において高速FMへの応答によって遮蔽された可能性があります。 。

A1 ニューロンと A2 ニューロンの間の差分時空間統合特性の根底にある細胞メカニズムと回路メカニズムは何ですか? 我々は以前、ソマトスタチンを発現する抑制性ニューロンが、A1 における遅い側方抑制 30 と FM 方向選択性 12 に寄与し、A217 における倍音の時間積分窓を制限することを発見した。 これらの結果は、特殊な抑制性ニューロンのサブタイプが、個々のニューロンの分光時間的統合マップにおける準線形性の形成に寄与していることを示唆しています。 樹枝状コンダクタンスが超線形集積と準線形集積の両方を駆動することが知られているため、回路レベルの相互作用に加えて、単一細胞メカニズムも非線形性に寄与する可能性があります。 特に、単一樹状突起の能動コンダクタンスは、入力 43、44 または同時入力 45、46、47 の時間的シーケンスを非線形に積分することができます。 これらの細胞機構が A1 ニューロンと A2 ニューロンの間の異なる音応答特性に寄与しているかどうかを調査することは、非常に興味深いものとなるでしょう。 また、これらの皮質領域における分光時間統合特性が上流の皮質下システムから部分的に受け継がれている可能性も排除しません。 視床ニューロンは高周波クリック列に従うことができるため、前方抑制は皮質起源であると考えられることが多い48,49が、二音刺激に対する非線形促進と抑制は、聴神経、蝸牛核、下丘などの皮質下構造で広く観察されている50。 、51、52、53、54。 それにもかかわらず、これらの周辺構造における非線形性の時間ウィンドウは通常より狭く (< 20 ms)、周波数領域と時間領域の両方に広く分布する複雑な皮質分光時間相互作用マップは、上流構造からの継承によって単純に説明される可能性は低いです。

A1 で見られる組み合わせ選択的な非線形応答は、二次聴覚野で種固有の発声など、より複雑な音を抽出するための中間段階と考えられています。 興味深いことに、A1 と A2 の 2 トーンの分光時間相互作用マップを比較することにより、これらの領域が重複しているが互いに異なる音響特徴をエンコードしていることがわかりました。 A1 における促進的相互作用が周波数と時間にわたって広く分布しているのとは対照的に、A2 ニューロンは一致する周波数を優先的に統合します。 したがって、私たちのデータは、これら 2 つの領域が異なる音声特徴、つまり A1 の FM と A2 の同時多周波音声の抽出に特化していることを示唆しています。 これらの結果は、A2 が複雑なサウンド表現を構築するための素材として A1 にエンコードされた情報に依存しているという考えと矛盾しているように見えます。 A2 は A1 だけでなく他の皮質領域や視床領域からも入力を受け取るため 55、A1 と A2 は連続的ではなく並行した情報抽出経路を形成する可能性があります 21、35、55、56。 たとえば、別の一次聴覚皮質である前聴覚野（AAF）は、A2 に隣接して位置しており、A2 での我々の発見と同様に、FM 方向の識別が不十分であることが報告されています57。 しかし、ある研究では、AAF ニューロンは A1 ニューロンよりも複雑な調和刺激に対する反応性がさらに低いことが判明しており、我々の以前の研究でも、調和スタックに対するより強い一致選好性が示されているため、A2 の分光時間統合特性が AAF からのみ受け継がれる可能性は低いと考えています。 AAF17よりもA2で。 A1、A2、および AAF ニューロンの異なる分光時間応答特性を考慮すると、それらの領域間の接続をさらに解剖学的に解剖することは、それらの階層構造を理解する上で非常に重要です。

私たちのデータは、A2ニューロンが時間情報ではなくスペクトル情報の統合に適していることを示唆していますが、より複雑な音（たとえば、3音またはより大きな音のシーケンス）を使用すると、A2におけるより精巧な分光時間相互作用を明らかにできる可能性を排除しません。 。 たとえば、本研究からの自然なフォローアップ疑問は、A1 と A2 が発声で一般的な多周波数サウンドを FM でどのようにエンコードするかということです。 A1 の FM 情報は A2 に転送され、その後そこで多周波数情報と統合されますか? あるいは、他の下流エリアは A1 と A2 から並列情報ストリームを受信して​​それらを統合しますか? 興味深い可能性の 1 つは、A1 と A2 の階層的または並列処理である 2 つの回路モデルが相互に排他的ではなく、サウンド入力に応じて異なる寄与で同時に動作するということです。 将来の経路固有の摂動実験は、これら 2 つの回路モデルが自然な音響特徴の認識をどのように区別してサポートするかを理解するために不可欠です。

実験時のマウスは生後6～12週目でした。 マウスは、Jackson Laboratories から入手しました: C57BL/6J。 Slc32a1tm2(cre)Lowl/J (VGAT-Cre); Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J (Ai9)。 雌と雄の動物の両方を使用し、21 °C、湿度 40% で逆光サイクル (12 ～ 12 時間) で飼育しました。 すべての実験は暗サイクル中に実行されました。 すべての手順は承認され、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の施設内動物管理使用委員会および国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。 研究結果はARRIVEガイドラインに従って報告されます。

聴覚刺激は、Matlab (Mathworks) でサンプル レート 192 kHz で計算され、自由音場静電スピーカー (ED1 スピーカー ドライバーを備えた ES1 スピーカー、Tucker-Davis Technologies) およびサウンド カード (Xonar DX、ASUS) を介して配信されました。 スピーカーは、1/4 インチの自由音場マイクロホン (4939- A-011; Brüel & Kjær) をマウスの左耳のおおよその位置に配置します。 ツートーン刺激は 2 つの 20 ミリ秒 70 dB SPL トーンで構成され、1 つのトーン (センター トーン) は視野内の画像化されたニューロンの母集団の最適周波数に固定されました (以下を参照)。 もう一方の音 (dF 音) は 9 つの周波数 (dF: 中心音を中心に -1 ～ 1 オクターブ、0.25 オクターブ間隔) から選択されました。 オンセットからオンセットまでのタイミングは、9 つ​​の間隔 (dT: − 100 ～ 100 ms、25 ms 間隔。負の値は先頭の dF トーンを示します) から選択されました。 合計における線形性の計算を可能にするために、個々のトーンもそれ自体で提示されました。 二光子イメージング実験中、音刺激は半ランダムな順序で提示されました。 トライアルの各ブロックは、すべての dT/dF ペアと個々のコンポーネント トーンをランダムな順序で 1 回ずつ含む刺激で構成され、5 つのトライアル ブロックが提示されました。 FM スイープ実験では、70 dB SPL でさまざまなレート (2.5、5、10、20、40、および 80 oct/秒) で上向き (4 ～ 64 kHz) および下向き (64 ～ 4 kHz) の対数 FM スイープを行いました。 最良の周波数は、30、50、および 70 dB SPL で 17 の周波数 (対数間隔、4 ～ 64 kHz) の 1 秒の純音を提示することによって決定されました。 帯域幅 (BW70) は、顕著な応答を引き起こした周波数範囲と、70 dB SPL でしきい値を超えるガウス フィットを伴う周波数範囲の平均として計算されました。 試行間の間隔は、二光子イメージング中のすべての刺激タイプについて 5 秒、固有信号イメージングについては 30 秒でした。 音刺激は、オンセットとオフセットで 3 ミリ秒の直線的な立ち上がりと立ち下がりを持っていました。 刺激は、イメージング部位の反対側の耳に送達されました。 聴覚刺激の送達は、Matlab 上で実行される Bpod (Sanworks) によって制御されました。

固有信号画像は、カスタム タンデム レンズ マクロスコープ (Nikkor 35 mm 1:1.4 レンズと 135 mm 1:2.8 レンズで構成) および 12 ビット CMOS カメラ (DS-1A-01M30、Dalsa) を使用して取得されました。 すべてのマウスには、最初にカスタムのステンレス鋼のヘッドバーが移植されました。 マウスは酸素中で蒸発させたイソフルオラン（0.8～2%）（1 L/分）で麻酔し、フィードバック制御された加熱パッド上で34～36℃に保った。 右聴覚皮質を覆う筋肉を除去し、ヘッドバーを歯科用セメントを使用して頭蓋骨に固定した。 最初のマッピングでは、リン酸緩衝食塩水で飽和させて透明に保った頭蓋骨を通して脳表面を画像化しました23。 二光子カルシウムイメージングの 1 ～ 3 日前に再マッピングするために、埋め込まれたガラス窓を通して脳表面をイメージングしました。 画像化の前に、マウスにクロルプロチキセン（1.5 mg/kg）を皮下注射した。 表面血管構造の画像は緑色 LED 照明 (530 nm) を使用して取得され、固有信号は赤色照明 (625 nm) を使用して記録されました (16 Hz)。 各試行は、1 秒のベースライン、その後の音刺激、および 30 秒の試行間隔で構成されました。 反射率の画像は 717 × 717 ピクセル (2.3 × 2.3 mm をカバー) で取得されました。 応答期間（音の開始から 0.5 ～ 2 秒）中の画像を平均化し、ベースライン中の平均画像で割りました。 画像は音ごとに 5 ～ 20 回の試行にわたって平均され、ガウス フィルター処理され、視覚化のために閾値処理されました。 個々の領域の応答振幅を定量化するために、Lucy-Richardson デコンボリューション法を使用して、2 次元ガウス ウィンドウ (σ = 200 mm) で画像のブレを除去しました。 A1、AAF、VAF、および A2 を含む個々の聴覚野は、純音 (1 秒、75 dB SPL、3、10、および 30 kHz) に対する反応によって決定される特徴的な音トピック構成に基づいて識別されました。 具体的には、A1 は、そのトノトピック勾配が背背方向 (低→高) に移動する最も尾側の領域として特定され、この領域にはおそらく以前の研究で超音波場 (UF) が含まれています 31。 VAFは、そのトノトピック勾配が吻腹側に移動する最も尾側の領域として特定されました。 A1 と VAF は、ほとんどの動物で低周波極に収束しました 12、17、35、36、59。 ＡＡＦは、ほとんどのマウスが尾腹側勾配を示し、そのトノトピック勾配が尾側に移動する最も吻側の領域として同定された。 最後に、A2 は、VAF と AAF の間の緊張応答ドメ​​インとして同定され、通常、腹側に伝わる弱い緊張トピック勾配を持っていました。 固有の信号イメージングと領域セグメンテーションのためのより完全なプロトコルは、以前の論文で説明されています23。

固有信号イメージングによる聴覚皮質領域のマッピングに続いて、硬膜を無傷のまま残して、聴覚皮質上に開頭術 (2 × 3 mm) が行われました。 穴あけは 1 ～ 2 秒ごとに中断され、過熱による損傷を防ぐために頭蓋骨はリン酸緩衝生理食塩水で冷却されました。 ウイルスを 5 ～ 10 箇所に注入しました (軟膜表面から 250 μm の深さ、10 nL/分で 30 nL/部位)。 錐体細胞イメージングのために、AAV9.syn.GCaMP6s.WPRE.SV40 (1 mL あたり 2 × 1012 ゲノム コピー) を C57BL/6J または VGAT-Cre×Ai9 マウスに注射しました。 ガラス窓を開頭部位の上に置き、歯科用セメントで固定した。 開頭術の前にデキサメタゾン (2 mg/kg) を注射しました。 マウスをホームケージに戻す前に、エンロフロキサシン (10 mg/kg) およびメロキシカム (5 mg/kg) を注射しました。 適切なレベルの GCaMP6s 発現を確保するために、慢性ウィンドウ移植の 2 ～ 3 週間後に二光子カルシウムイメージングを実行しました。 2 回目の固有信号イメージング実験は、無傷の聴覚皮質マップを確認するために、カルシウムイメージングの 1 ～ 3 日前に慢性ウィンドウを通じて実行されました。 カルシウムイメージングの当日、覚醒したマウスは特注の音響減衰チャンバー内の二光子顕微鏡下で頭部を固定されました。 通常、マウスは 1 ～ 2 時間頭を固定している間、ストレスに関連した激しいもがきの兆候を示さずに目覚めていました。 GCaMP6s は 925 nm (InSight DS+、Newport) で励起され、画像 (620 × 620 μm をカバーする 512 × 512 ピクセル) は、Scanimage ソフトウェア (Vidrio) を実行する市販の顕微鏡 (MOM スコープ、Sutter) で 16 倍の対物レンズを使用して取得されました (ニコン）30Hz。 3 匹のマウスの A1 について 2 つの視野が画像化され、合計 12 の視野が得られました。 画像は L2/3 (表面下 200 ～ 300 µm) から取得されました。 横方向の動きは、相互相関ベースの画像位置合わせによって補正されました60。 音声配信のタイミングは、Wavesurfer ソフトウェア (Vidrio) でタイミング TTL 信号を記録することにより、イメージング フレームに合わせて調整されました。 実験は通常 2 日間にわたって行われました。 初日に、純音応答を測定することによって、個々のニューロンの最良の周波数が決定されました。 2日目は1日目と同じ視野でツートーン実験を行いました。 ほとんどの動物では、FM スイープ実験も 2 日目に実施されました。 個々のニューロンにおいて、最良の周波数は、音の強度とは無関係に最も強い応答を持つ周波数として計算されました。 母集団の最良周波数は、各画像化視野における最良周波数分布ヒストグラムのピークとして決定されました。

個々の細胞体に対応する関心領域 (ROI) は、Suite2P ソフトウェア (https://github.com/cortex-lab/Suite2P) によって自動的に検出され、手動描画によって補足されました。 ただし、バックグラウンド信号の過剰な減算がよく観察されたため、ROI 検出後に Suite 2P の分析パイプラインは使用しませんでした。 すべての ROI は個別に検査され、Matlab のカスタム グラフィカル ユーザー インターフェイスを使用して適切な形状に編集されました。 各 ROI 内のピクセルを平均して、蛍光時系列 Fcell-meausred(t) を作成しました。 背景の汚染を補正するために、各セル ROI の周囲にリング状の背景 ROI (ROI の境界から 2 ピクセルで始まり 8 ピクセルで終わる) が作成されました。 この背景 ROI から、細胞体または周囲の細胞からの突起を含むピクセル (イメージング セッション全体で細胞 ROI の値と相関しない dF/F の大きな増加を示したピクセルとして検出) が除外されました。 残りのピクセルを平均して、バックグラウンド蛍光時系列 Fbackground(t) を作成しました。 細胞体の蛍光シグナルは、F(t) = Fcell_measured(t) – 0.9 × Fbackground(t) として推定されました。 確実にニューロピルサブトラクションを行うために、背景 ROI より少なくとも 3% 明るい細胞 ROI のみを含めました。 正規化された時系列 dF/F は、まれに非常に低いベースライン値による除算を避けるために、F(t) に小さなオフセット (20 au) を追加した後に生成されました。 GCaMP6 の遅い反応速度を考慮して、応答検出ウィンドウは、1 秒の純音の場合は音の開始から 1.2 秒、ツートーン刺激の場合は音の開始から 1 秒、FM スイープ刺激の場合は音の開始から音のオフセット後の 0.3 秒でした。 音誘発反応は、反応検出ウィンドウ中のベースラインを差し引いた dF/F トレースの曲線下の面積として測定されました。 細胞は、次の 2 つの基準を満たした場合に著しく興奮していると判断されました。1) dF/F は、試行の半分以上で少なくとも 0.5 秒間連続して固定閾値を超えなければなりませんでした。 2) トライアル全体で平均された dF/F は、少なくとも 0.5 秒間連続して固定閾値を超えなければなりませんでした。 興奮の閾値 (ベースライン期間中の 3.3 × SD) は、トーン反応で 90% の真陽性率が得られるように、受信者操作特性 (ROC) 分析によって決定されました。 2光子イメージングフィールドは、血管パターンを比較することによって固有の信号イメージングフィールドと位置合わせされ、固有のイメージングによって決定された領域境界の外側のROIはさらなる分析から除外されました。

ツートーン実験では、図3bの正規化された応答の大きさは、少なくとも1つのdTで顕著な興奮性応答を伴うROI-dFペアに対して計算されました。 各 ROI-dF ペアについて、応答振幅は dT 全体の最大値に正規化され、これらの値は各皮質領域のすべての dF および ROI にわたって平均されました。 直線性指数 (LI) は、各音刺激の提示の少なくとも 5 回の試行にわたる平均 dF/F トレースを使用して決定されました。 各 ROI について、dF-dT ペア、中心音、または dF 音で有意な興奮性反応が誘発された場合にのみ、各 dF-dT の組み合わせについて LI が計算されました。 LI は (T − L)/(T + L) として計算されました。ここで、T は 2 つのトーン刺激に対する応答を表し、L は単独で提示されたトーンに対する応答の線形総和を表します。 応答振幅は、応答検出ウィンドウ中の平均 dF/F 値として計算され、LI 範囲を - 1 と 1 の間に維持するために、負の振幅は強制的に 0 に設定されました。分光時間相互作用マップは、2 次元ガウス フィルター (標準) を適用することで滑らかになりました。偏差 = 0.4、dF 軸と dT 軸のそれぞれ 0.1 oct と 10 ms に相当) を 9 × 9 LI 行列に変換します。 有意な非線形積分を持つ dF-dT ペアは、ツートーン応答 (5 回の試行) の振幅分布を、線形合計された成分トーン応答のすべての組み合わせと比較することによって決定されました (中心トーンの 5 回の試行 × dF トーンの 5 回の試行 = 25 の組み合わせ)。 。 p 値は Wilcoxon 順位和検定を使用して計算され、試行数が少ないため、比較的高い有意水準 0.1 が使用されました。

図3eでは、ニューロンは、シフトされたまたは同時の2トーン刺激に対する優先的な反応によって分類されました。 2 つのトーン応答ニューロンは、一致する (シフトされた) 2 つのトーンの応答振幅が、シフトされた (一致する) 2 つのトーンの応答振幅よりも 1.5​​ 倍以上大きい場合、一致 (シフト) 優先として分類されました。 シフト優先ニューロンのうち、負 (正) dT の応答振幅が正 (負) dT の応答振幅より 1.5 倍以上大きい場合、ニューロンはさらに負 (正) dT 優先として分類されました。 シフトされた刺激の応答振幅は、5 dF × 8 シフト dT = 40 dF-dT ペアの平均として計算され、同時刺激の反応振幅は 5 dF の平均として計算されました。 図3fの非対称指数は|(P − N)/(P + N)|として計算されました。ここで、PとNは、それぞれ正と負のdTを持つ2つのトーンによってトリガーされる応答振幅の合計を表します。 上方領域と下方領域の間の促進的相互作用と抑制的相互作用の非対称性を個別に定量化するために、上方領域と下方領域間の合計 LI の差として線形性指数バイアス (Biasfac および Biassupp) も計算しました。 上向き領域は、dF > 0、dT > 0 および dF < 0、dT < 0 象限の組み合わせとして定義され、下向き領域は、dF > 0、dT < 0 および dF < 0、dT > 0 象限の組み合わせとして定義されました。 Biasfac (Biassupp) は、上向き領域と下向き領域の間の合計された正 (負) LI の差として計算されました。

アンサンブル活動パターンを測定するために、すべてのマウスのニューロンを A1 および A2 データに対して個別に結合し、高次元空間で集団応答ベクトルを分析しました。 各 dF-dT ペアについて、各領域の集団応答ベクトルは、マウス全体のすべての ROI の応答振幅を連結することによって作成されました。 有意でない応答は、ノイズ除去のために強制的に 0 に設定されました。 個々のトーンおよび個々のトーンの線形和についても、母集団応答ベクトルが生成されました。 ピアソンの相関係数は、ツートーン刺激に対する母集団の応答ベクトルと線形和の間で計算され、dF 全体で平均されました。 同様に、ツートーン刺激に対する集団反応ベクトルと個々のトーンの間の相関係数が計算され、dF と両方のトーンにわたって平均されました。

方向選択性は、各 FM スイープ刺激の提示の 5 回の試行にわたる平均 dF/F トレースを使用して決定されました。 DSI は (U − D)/(U + D) として計算されました。ここで、U は上向き FM スイープによってトリガーされる応答振幅を表し、D は下向き FM スイープによってトリガーされる応答振幅を表します。 各 ROI について、DSI は、少なくとも 1 つの方向に顕著な興奮反応を引き起こした FM レートのみを使用して計算されました。 応答振幅は、応答測定ウィンドウ中の平均 dF/F 値として計算され、DSI 範囲を -1 ～ 1 の間に保つために負の振幅は強制的にゼロに設定されました。応答振幅は、上向きまたは下向きの 10 ～ 40 oct/s FM レートにわたって平均されました。各 ROI に対して単一の DSI 値を計算するための指示 (図 4d、e 上)、または各 FM レートに対して個別に計算する (図 4c-e 下、および補足図 3)。 A1 スイープ分析に含まれる 4 匹のマウスは、以前の研究で使用されたデータから再分析されました 12。

すべてのデータは平均値 ± SEM として表示されます。 条件間の統計的に有意な差は、Matlab の標準パラメトリック テストまたはノンパラメトリック テストを使用して決定されました。 対応のある検定には両側対応のある t 検定を使用し、独立したグループの比較にはウィルコクソンの順位和検定を使用し、分数の比較にはカイ二乗検定を使用しました。 複数のグループを比較するには、ボンフェローニ補正を適用して p 値を調整するか、二元配置分散分析に続いて Tukey の正直有意性検定を使用しました。 n がマウスの数または細胞と音のペアの数を指すと明示的に述べられている場合を除き、すべての n 値は細胞の数を指します。 サンプルサイズは統計的手法によって事前に決定されたものではなく、現場で一般的に使用されているものに基づいていました。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手可能になります。

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原稿に関してコメントをくださった塚野弘明氏とミシェル・ガルシア氏に感謝します。 この研究は、NIDCD (R01DC017516)、NIH BRAIN Initiative (RF1NS128873)、Pew Biomedical Scholarship、Whitehall Foundation、Klingenstein-Simons Fellowship、Foundation of Hope (HKK)、および NINDS (F31-NS111849、T32-NS007431; AMK) によって支援されました。

アンバー M. クラインとデスティニー A. アポンテの著者も同様に貢献しました。

ノースカロライナ大学チャペルヒル校精神科、チャペルヒル、ノースカロライナ州、27599、米国

アンバー・M・クライン、デスティニー・A・アポンテ、K・カトウヒロユキ

ノースカロライナ大学チャペルヒル校神経科学センター、チャペルヒル、ノースカロライナ州、27599、米国

アンバー・M・クライン、デスティニー・A・アポンテ、K・カトウヒロユキ

カロライナ発達障害研究所、ノースカロライナ大学チャペルヒル校、チャペルヒル、ノースカロライナ州、27599、米国

Hiroyuki K. Kato

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AMK、DAA、HKK がプロジェクトを設計し、データを分析しました。 AMKとDAAは実験を実施した。 AMKとHKKが原稿を書きました。

加藤宏之氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Kline、AM、Aponte、DA、Kato、HK 一次および二次聴覚皮質における独特の非線形分光時間統合。 Sci Rep 13、7658 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34731-6

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受信日: 2023 年 1 月 10 日

受理日: 2023 年 5 月 6 日

公開日: 2023 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34731-6

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