偶然にも適合したタンパク質表面がシアノバクテリアの光防御におけるアロステリック制御のプライミングを引き起こした

May 20, 2023

Nature Ecology & Evolution volume 7、pages 756–767 (2023)この記事を引用

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138 オルトメトリック

メトリクスの詳細

タンパク質間の高度に特異的な相互作用は生命の基本的な前提条件ですが、それらがどのように進化するかは未解決の問題のままです。 特に、最初は無関係だったタンパク質間の相互作用では、それらが一致する表面に進化する必要があります。 このような表面の適合性が、少しずつ段階的に選択することによってのみ構築できるのか、それとも偶然にも出現する可能性があるのか​​は不明です。 今回我々は、分子系統学、祖先配列の再構成、復活したタンパク質の生物物理学的特性評価を利用して、シアノバクテリアの光防御システムで作用する2つのタンパク質間のアロステリック相互作用の進化を追跡した。 われわれは、オレンジ色のカロテノイドタンパク質（OCP）と、その無関係な調節因子である蛍光回復タンパク質（FRP）との間の相互作用が、FRPの前駆体がシアノバクテリアによって水平に獲得されたときに進化したことを示す。 FRP の前駆体は、これらのタンパク質が祖先のシアノバクテリアで最初に互いに遭遇する前からすでに OCP と相互作用し、制御することができました。 OCPとFRPの相互作用は、OCPの古代の二量体界面を利用しており、これも光防御システムへのFRPの導入より前から存在しています。 私たちの研究は、進化がどのようにして既存のコンポーネントから複雑な規制システムを簡単に構築できるかを示しています。

タンパク質間のアロステリック相互作用は、あるタンパク質の活性部位が別のタンパク質の遠位部位への結合によって影響を受ける、生化学的調節の遍在的な形態です1。 このような相互作用がどのように進化するかは、進化生化学における未解決の問題です。 それには、両方のタンパク質（レギュレーターとターゲット）が、適合するインターフェースと、レギュレーターの結合をターゲットタンパク質の活性部位の変化に変換する何らかのメカニズムを進化させる必要があります。 このインターフェースと伝達機構に関与するすべての残基が新たに進化する必要がある場合、そのような相互作用を構築するには、両方のタンパク質でいくつかの置換が必要になります。 複数のタンパク質のいくつかの置換を含む長い遺伝的軌跡がランダムな遺伝的浮動によって修正される可能性は非常に低いため、既存の相互作用は通常、漸進的な突然変異の段階で構築されたものと考えられます。 各ステップでは単一の相互作用する残基が追加され、相互作用に関連する機能に直接作用する自然選択によって固定が引き起こされます2。 しかし、いくつかのタンパク質系では、2 つのパートナーのうちの 1 つにインターフェースまたはアロステリック経路が偶然にも存在していました 3、4、5、6。 これは、これらの相互作用のいくつかの側面が偶然に生じ、その後に生じた他のコンポーネントによって悪用されたことを示しています。

標的上の既存の表面を利用する新しい調節剤の相互作用表面など、相互作用のこれらの残りの構成要素を形成するために、どの程度直接選択が必要であるかは依然として不明である。 原則として、これらの機能は、インタラクションとは関係のない理由で最初に修正された場合、完全に偶然である可能性もあります。 よく研究されたすべてのケースにおいて、この質問に答えることはできません。なぜなら、両方の構成要素は、標的と調節因子が常に互いに遭遇していたであろう同じゲノム内に由来するためです。そのため、選択は調節因子をその新しい標的に適応させるように作用したかもしれないし、作用しなかったかもしれません3。 4、5、6。 したがって、生物学的に意味のある相互作用が本当に偶然に生じたのかどうかは不明のままである。

ここでは、シアノバクテリアの光保護システムにおけるアロステリック相互作用の進化を研究することで、この問題に対処します7,8。 光活性生物は、光損傷を引き起こす強い光照射から身を守らなければなりません。 シアノバクテリアでは、この保護はオレンジカロテノイドタンパク質 (OCP)9,10 によって媒介されます。これは、不活性オレンジ (OCPO) から活性赤色に構造を切り替えることができるカロテノイドが 2 つのドメインに対称的に埋め込まれた光活性光強度センサーです。強い光条件下での状態 (OCPR)11. 活性化された OCPR は、シアノバクテリアの集光アンテナ複合体であるフィコビリソームに結合し、過剰なフィコビリソームの励起を熱として消散します 11,12。 2 つの OCP パラログ (OCP2 および OCPx) は、暗所でフィコビリソームから分離し、受動的に OCPO に回復することができます 11,13。 しかし、最も一般的なパラログ OCP1 は、光回復のアロステリック制御に依存しています。OCP1 は、フィコビリソームとの相互作用を終了させる小さな二量体制御因子である蛍光回復タンパク質 (FRP) と相互作用し、OCPR の逆変換を強力に加速します。静止オレンジ状態14,15 (図1a)。 光スイッチ不可能な前駆体からの OCP の進化の可能性が最近実証されました 16 が、FRP がどのようにしてシアノバクテリアの光防御システムに新しいアロステリック調節因子として組み込まれたのかはまだわかっていません。

a、OCP1パラログにおけるFRP（シアン）によるアロステリック制御を含む、シアノバクテリアに限定されたOCP媒介光保護のメカニズム。 使用される構造 (PDB ID): 7EXT (参照 57)、3MG1 (参照 58)、4JDX (参照 25)、および 7SC9 (参照 29)。 PBS、フィコビリソーム。 b、示された光変換からの回復の相対速度を伴うOCPパラログのML系統発生の減少、および選択されたクレードの再構築された祖先タンパク質（Anc）。 シアノバクテリア CTDH はアウトグループです。 太字の数字は、指定された OCP パラローグの分類群を数えます。 斜体の数字は、100 回の反復のフェルゼンシュタイン ブートストラップ確率です。 分岐の長さは、部位ごとの平均置換を表します。 完全なツリーを拡張データ図 1 に示します。c、Synechocystis sp. の現存 OCP1 と比較した AncOCPall の不活性オレンジおよび活性レッド状態の紫外可視吸収スペクトル。 PCC 6803 (SYNY3; 破線)。 d – f、SYNY3 FRPあり（シアン）またはなし（黒）の20℃での祖先OCPの光変換からの回復、および3つの独立した複製の標準偏差を伴うそれぞれの平均回復時定数（τ）：AncOCPall（d）、AncOCP1＆2（e） ) および AncOCP1 (f)。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。

OCP1とFRPのアロステリック相互作用の進化的起源をたどるために、我々はまずOCPパラログがどのように進化し、いつFRPによって制御される能力を獲得したのかを理解しようとしました。 最近、最初の OCP はおそらく 2 つの小さなタンパク質の遺伝子融合事象を介して進化したこと、およびリンカーの付加により光スイッチ能が提供されたことが示されました 16。 これらの単一ドメインタンパク質の相同体は現存するシアノバクテリアで依然として見出されており、核輸送因子 2 タンパク質 (NTF2) の共通の折り畳みを特徴とするヘリックスカロテノイドタンパク質 (HCP) および C 末端ドメイン様相同体 (CTDH) と呼ばれています17。 。 まず、シアノバクテリアの CTDH 配列をツリーの根元となるアウトグループとして使用して、OCP タンパク質の最尤 (ML) 系統発生を推定しました (図 1b および拡張データ図 1)。 さらに、拡張データ図 2 で HCP 配列を使用した代替ルートについて説明します。私たちの系統樹は、最近公開された系統樹 16 と実質的に同一であり、OCPx、OCP2、および OCP1 がそれ​​ぞれ十分にサポートされた単系統グループを形成しています。 OCP1 と OCP2 は姉妹グループであり、他のすべての OCP は除外されます。 OCPx グループと OCP1 および OCP2 の間でさらに 2 つの未特徴分岐群が分岐しており、これらは追加の OCPx であるか、別個のパラログである可能性があります。

我々は、祖先配列再構成を使用して、ツリーの内部ノードで、および FRP 制御 OCP1 に向かう系統に沿った祖先 OCP のアミノ酸配列を推測しました。 我々は、現存するすべての OCP (AncOCPall) の最後の共通祖先 (LCA) から、OCP1 および OCP2 パラログ (AncOCP1&2) の LCA、現存する OCP1 (AncOCP1) の LCA までの 3 つのタンパク質に焦点を当て、これらを平均事後確率で再構成しました。 0.92 ～ 0.96 のサイト (図 1b および拡張データ図 3a ～ e)。 我々は、これらの祖先 OCP タンパク質を大腸菌内で異種的に復活させ、in vitro 特性評価のために精製しました。 すべての祖先のOCPは、優先カロテノイドとして結合エキネノンを備えた光切り替え可能な光強度センサーです（図1cおよび拡張データ図4a〜h）。 AncOCPall は、OCPR から OCPO への逆変換において 166 ± 10 秒という中程度の時定数を示します (現存する OCP2、参考文献 16 と同様)。 回復定数は、AncOCP1&2では20±1秒（現存するOCPより速い）に減少しますが、AncOCP1では314±8秒（現生OCP1と同様）に劇的に増加します（図1d〜fおよび拡張データ図4i〜l）。 私たちのデータは、遅い光回復がOCP1への分岐に沿って進化した特徴であることを示しており、アロステリックに加速された回復のためにFRPを必要とするのはOCP1パラログだけであるという理論と一致しています。

次に、シネコシスティス属の現存する FRP の効果をテストしました。 祖先の OCP の回復時間に関する PCC 6803。 2 つの以前の祖先は FRP の影響を受けませんが、AncOCP1 は FRP の存在下 (モル比 5 OCP 対 1 FRP) でのみ急速に回復することができ、これにより OCPR から OCPO への逆変換が約 97% 加速されます (現存する OCP1) (図 1d–f および拡張データ図 4m–t)。 AncOCP1&2はFRPの影響を受けないため、OCP1とOCP2のパラログを生じさせる遺伝子重複事象の後、OCP1への分岐に沿ってのみ、OCPの回復のアロステリックな加速が進化した。

祖先ごとに、可能性は低いが統計的にもっともらしい代替配列をさらに 1 つ復活させることにより、復活配列の統計的不確実性に対する結論の堅牢性をテストしました (詳細については「方法」を参照)。 これらの代替祖先OCPタンパク質の生物物理学的特徴付けにより、FRPによる遅い回復と加速がOCP1につながる分岐に沿って進化したことが確認されています（拡張データ図5a-l）。

次に我々は、FRP 調節 OCP1 を生成する遺伝子重複と比較して、FRP がシアノバクテリアのゲノムに初めて出現したのはいつなのかを尋ねました。 これに答えるために、OCP ツリー上で見つかった OCP 含有シアノバクテリア株の ML 種系統発生を推定し、FRP および OCP パラログの存在をその上にマッピングしました (拡張データ図 6)。 事実上、OCP1 を含むすべてのゲノムには FRP も含まれており、OCP1 を生成する重複に近い時期に FRP が獲得されたことが示唆されます。 OCP2 および OCPx パラログの分布は非常に散発的であり、各 OCP クレード内の関係はほとんど解明されていないため、種の系統発生上のどこで連続した OCP 重複が発生したかを正確に知ることは困難です。 私たちや他の人の種系統図18、19、20、21では他のすべてのシアノバクテリアの姉妹であるグロエオバクテリアはOCPxのみを持っていますが、直後に分岐したグループはすでにOCP1とFRPまたはOCP2、あるいはその両方を持っています。 これは、OCP1 と OCP2 を生成する重複が、Gloeobacter spp.の発生後、比較的早く起こったことを示唆しています。 他のすべてのシアノバクテリアから分離され、FRP もほぼ同時にシステムに組み込まれました。

次の目標はFRPの起源を理解することでした。 FRP の相同体 (FRP 様、FRPL と呼ばれる) は、遠縁の細菌、主にプロテオバクテリアとアシドバクテリアにも見られ、シアノバクテリアをはるかに超えた起源が示唆されています。 この理論を検証するために、我々はシアノバクテリアの内外で FRP ホモログを広範囲に検索し、ML の系統発生を推測しました。 私たちのツリーは、すべての FRP とすべての FRPL の間で高度にサポートされている分割を特徴としています (図 2a)。 デルタプロテオバクテリア FRPL の小グループは、高い統計的裏付けを備えたシアノバクテリア FRP グループに最も近い分岐を示します (近似尤度比検定 (aLRT) = 60.9、転移ブートストラップ期待値 (TBE) 0.99)。 ただし、一部のブートストラップ実行では、長い末端分岐を持つ他の細菌分類群の FRPL がこのグループに飛び込み、その結果フェルゼンシュタイン ブートストラップ サポートが不十分になります (FBP = 0.51)。しかし、デルタプロテオバクテリア FRPL はすべての実行において FRP の姉妹のままです。 さらに、FRPL はプロテオバクテリアとアシドバクテリアに散発的に分布しており、ほとんどが未培養種に見られます (モデル生物にはまったく存在しません)。 プロテオバクテリアの異なるグループ内では、おそらく FRP および FRPL タンパク質の長さが短いため、このツリーはあまり分解されません。

a、シアノバクテリア FRP (シアン) の ML 系統発生の減少、およびこの研究で調べたものと相同な FRPL タンパク質をマゼンタの円とその宿主種の名前で示します。 太字の数字は、崩壊した細菌グループの分類群を数えます。 斜体の数字は 100 回の反復の TBE を示します。 このツリーはプロテオバクテリアとアシドバクテリアの間に根を下ろしており、デルタプロテオバクテリアとシアノバクテリアの間の HGT を示しています (赤線)。 分岐の長さは、部位ごとの平均置換を表します。 完全なツリーを補足図1に示します。 b、ヘッドドメインが示された1.8ÅのP. borborori由来のFRPLホモ二量体の結晶構造（PDB ID 8AG8） c、FRPによる回転オーバーレイ（Synechocystis sp由来のPDB ID 4JDX） .PCC 6803、参考文献 25)。 rmsd、二乗平均平方根偏差。

私たちは、最も節約的な根仮説として、FRPL グループ内のアシドバクテリアとプロテオバクテリアの間にツリーを根付かせました。 この根は、祖先デルタプロテオバクテリアから祖先シアノバクテリアへの遺伝子水平転移（HGT）を示し、さらにアシドバクテリアとプロテオバクテリアにおけるFRPLの散発的な損失が多数あることを示しています（図2a）。 対照的に、FRP グループ内の根は、多かれ少なかれもっともらしい HGT イベントを必要とします。少なくともシアノバクテリアから少数のプロテオバクテリアへ、次にアシドバクテリアへ、そして比較的現代的なアシドバクテリウムから初期のプロテオバクテリアへ。 FRPとFRPLの間のルートには、すべての細菌のLCAにおけるタンパク質の起源が必要です23。これは、多くの大きな細菌グループの損失と、現代のアシドバクテリアからプロテオバクテリアのLCAへの同様の一時的に信じられない転移を示します（補足説明を参照）詳細）。 結果として、我々の結果は、FRP がラン藻の歴史の初期に祖先ラン藻によって水平方向に獲得された可能性が最も高いことを示しています。

FRPLタンパク質がシアノバクテリアに移入される前の祖先の状態を理解するために、我々は、FRPL（PbFRPL）を特徴とする数少ない単離された中温性細菌の1つであるガンマプロテオバクテリウムシュードモナス・ボルボリ（近縁種）のFRPLを異種発現、精製、特性評価した。緑膿菌の２４． PbFRPL の円二色性分光法では、溶液中の FRP で以前に見られた典型的な全アルファらせん構造の折り畳みが示され、ネイティブ質量分析法では特徴的な二量体状態が確認されました 8,14 (拡張データ図 7a-c)。 私たちは、PbFRPL の結晶構造を 1.8 Å の分解能で解析しました (表 1)。 N 末端ドメインは、長さ約 50 Å の 2 つの逆平行αヘリックスで構成され、FRP のホモ二量体化界面と同様のホモ二量体化界面を特徴とし、推定埋め込み表面は約 675 Å2 です。 FRPにあるC末端ヘッドドメインはOCP1と相互作用すると考えられており(参考文献25、26、27)、PbFRPLにも存在し、3つの連結したαヘリックスを構成している。 全体として、PbFRPL および FRP は Synechocystis sp. から得られました。 PCC 6803（タンパク質データバンク（PDB）ID 4JDX、参考文献25）は、2.08Åの二乗平均平方根偏差で重ね合わされます（図2b、c）。 したがって、PbFRPL の構造特性はシアノバクテリア FRP の構造特性と非常に似ています。

FRPLがどのような機能を実行するかは不明であるが、FRPLを含むゲノムにはOCPも、そのN末端ドメインまたはCTD様タンパク質(それぞれHCPおよびCTDH)のホモログも含まれないため、FRPLがOCPを調節している可能性はない。 P. borbari では、frpl 遺伝子はその単一の染色体上にコードされており、OCP、HCP、または CTDH 相同体は見つかりませんでした (拡張データ図 7d)。 mVenusフルオロフォアに融合し、P. borbororiのネイティブプロモーターの下でプラスミドから発現させたPbFRPLの落射蛍光顕微鏡検査では、指数関数的増殖中は細胞全体に均一に分布し、全細胞量が増加すると飢餓時には細胞極でのさらなる濃度が示された。積分蛍光は野生型の約 2.5 ～ 3.4 倍増加しました (拡張データ図 7e-g)。 ここではタンパク質のコピー数を制御できないことに留意すると、PbFRPLの局在化と量が飢餓に応じて変化することが注目に値します。 我々のデータは、FRPLが非常に類似した構造にもかかわらず、OCPや光防御の調節とは全く無関係であるはずの潜在的にストレスに関連した機能を実行していることを示している。

FRPLとFRPの折り畳みの共有は、FRPLがOCPと生産的に相互作用できる可能性があることを示唆しており、これはFRPLがシアノバクテリアに導入された後、光防御システムで即座に機能するために追加の修飾を必要としない可能性があることを意味する。 これをテストするために、我々は現存種からいくつかの FRPL を精製し、現存する OCP1 の光回復に対するそれらの影響を調べました。 私たちは、系統樹上の FRPL 含有細菌グループの多様性にわたる 4 つの生物から FRPL を選択しました。 （別のガンマプロテオバクテリア）、クロロビ sp. （FCBグループ種）とDesulfobacteraceae科のデルタプロテオバクテリウム。これは、私たちの木の上のシアノバクテリアへのHGTイベントに最も近い現存配列の1つを表します（図2a）。 P. borbari、Methylocaldum sp. 由来の FRPL とクロロビ sp. OCP1 の光回復には実質的に影響がありませんでした。 ただし、Desulfobacteraceae FRPLは、OCP1単独と比較して、光変換からのOCP1の回復の約93％の典型的な加速を示しました（OCP1とFRPLの等モル比でインキュベートした場合）（図3a、bおよび拡張データ図7h–k） 。 これは、FRP をシアノバクテリアに最初に移入した HGT イベントの時点で、OCP1 を調節する能力がすでに存在していたことを示しています。 この理論をさらに検証するために、我々はさらに 2 つの祖先タンパク質を復活させました。FRPLpreHGT は HGT イベント前に再構築できる最新の FRPL であり、FRPpostHGT は HGT 後のシアノバクテリアのすべての FRP の LCA を表します (図 3c)。 どちらの祖先タンパク質も、OCP1の光回復に対する典型的なFRPの加速効果を示し、現存するFRPとほぼ同様に機能します（図3d、eおよび拡張データ図8a-d）。 この推論は、合計でより少ない配列で以前に推論した初期FRP（L）系統発生に基づいて、わずかに異なる配列を持つ代替の祖先FRPおよび祖先FRPLタンパク質に対してさらに堅牢です（拡張データ図8e-j）。

a、b、Synechocystis sp.からの現存OCP1の光変換からの回収。 PCC 6803 (SYNY3) の現存する P. borborori (a) または Desulfobacteriaceae (Desulfo.) 種 (b) の FRPL を異なるモル比で 20 °C で示し、それぞれの平均回復時定数 (τ) と 3 つの独立した標準偏差複製します。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。 ND、判断不能。 c、再構築された祖先タンパク質とテストされた現存FRPLを含む概略的なFRP（L）系統発生。 完全なツリーを補足図1に示します。 d、e、（d）の前に存在した祖先FRPL（FRPLpreHGT）、およびHGT（e）後に存在した祖先FRP（FRPpostHGT）を使用した現存SYNY3 OCP1の光変換からの回復20℃での異なるモル比を、3つの独立した複製のそれぞれの平均回復時定数（τ）および標準偏差とともに示します。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。

まとめると、我々の結果は、ほとんどのFRPLはOCP1のアロステリック調節因子として機能できないが、そのうちの小さなサブグループが偶然にこの能力を獲得したことを示している。 これはOCPを含まないゲノムで起こったことであるため、この能力は完全に偶然であり、直接的な自然選択の結果であるはずはありません。 原理的には、これにより、タンパク質が最初にゲノムに導入された瞬間に、シアノバクテリアの全く無関係な光保護システム内でタンパク質が機能することが可能になったであろう。

一部の FRPL はシアノバクテリアに入る前から OCP との相互作用に向けて準備されているようであるため、たとえ光回復を加速するアロステリック結合がまだ完全に進化していなかったとしても、それらの相互作用のための界面は AncOCPall にもすでに存在している可能性があると我々は推論した。 現存するFRPとインキュベートした光活性化赤色型AncOCPall（AncOCPallR）の分析サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、AncOCPallR単独と比較してサイズの増加を示し（図4a）、FRPがすでにAncOCPallRに結合していることを示しています。 OCPRからOCPOへの回収反応に過剰のFRPを加えることによってアロステリック反応を引き起こすことができるかどうかを尋ね、最初の実験を繰り返しました（図1d）が、今回はOCPに対してはるかに大きなFRPのモル比を使用しました。 驚いたことに、（FRPに対するOCPの）等モル量と5倍モル過剰のFRPを使用すると、回復時間は加速するどころか、それぞれ166±10秒から288±10秒と609±5秒に大幅に増加しました（図） .4b)。 この減速は、AncOCP1&2、および祖先 FRP または祖先 FRPL のいずれかを追加した場合にも現れました (図 4c および拡張データ図 4u–x)。 この速度の低下が立体効果または分子の混雑によってのみ引き起こされることを除外するために、PbFRPL (モル過剰に添加した場合でも、OCP1 の回復時間には実質的に影響を与えません: 図 3a) を使用して実験を繰り返し、同様に実質的にAncOCPall の回復には影響しません (拡張データ図 4y)。

a、クロマトグラフィー中の一定の青色光照明（OCPO）を使用した場合（OCPR）または使用しない場合のAncOCPallおよびAncOCPall-FRP複合体の分析SEC。 b、c、Synechocystis sp.からの現存FRPの異なるモル比によるAncOCPallの光変換からの回収。 20 °C での PCC 6803 (SYNY3) (b) または FRPpostHGT (c) と、3 つの独立した複製のそれぞれの平均回復時定数 (τ) および標準偏差。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。 bの「FRPなし」と「5:1 FRP」のデータは、比較のために図1dから取得したものです。 d、FRP (シアン) と SYNY3 OCP1 (緑色) の CTD 間の相互作用の AlphaFold2 モデル。 e, AncOCPall (小麦) を OCP1 上にオーバーレイした、ズーム (d の黒枠領域) をバインディング インターフェイスに回転させた。 結合に関与するアミノ酸は標識されています。 両方の OCP で保存されているサイトは黒で表示されます。 青が窒素、赤が酸素。 残基番号は SYNY3 OCP1 の後に続きます。 挿入図は、再構築された AncOCPall タンパク質の結合界面にある示されたアミノ酸の PP を示しています。 f、照明なしの祖先OCPOのネイティブPAGE（左）、および一定の青色光照明下でのOCPR（右）は、それらのオリゴマー状態を示しています。 OCP1との比較（参考文献29、58）は、OCPOとOCPRでは保存された二量体化界面が異なることを示しています。 両方とも照明非依存性二量体を形成するOCP変異体(70 kDa)およびOCP1のCTD(29 kDa)を分子マーカーとして使用した。 実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。

したがって、FRP のみを結合するだけでは、アロステリック効果を加速させるのに十分ではありません。 その代わりに、FRP が高モル過剰になると、AncOCPall の光回復が妨げられます。 弱い結合が繰り返される場合、または適切なタイムスケールで解離しない FRP は、AncOCPall の回復プロセスを中断または遅延させる可能性があります。 さらに、現存するOCP1が複雑で高効率なアロステリック応答を実現するには、N末端ドメインとCTDの間の柔軟なリンカーループや短いN末端伸長などのOCP側の構造的特徴をさらに微調整する必要がある可能性がある。場所16、26。

私たちの実験は、すべてのOCPのLCAがすでにFRPと相互作用する潜在的な能力を持っていることを示していますが、この相互作用はまだ回復を加速することができませんでした。 これは、OCP と FRP の間の少なくともこの相互作用の可能性が、これらのタンパク質が祖先のシアノバクテリアで最初に互いに遭遇する前であっても、純粋に偶然に進化したことを意味します。

この潜在的な親和性の構造的基礎を理解するために、OCP1-FRP複合体のAlphaFold2（参考文献28）モデルを推論しました。 これは、以前の小角X線散乱データと一致する、OCP1のCTDとFRPの間の相互作用を自信を持って予測しました（図4dおよび拡張データ図9a、f）。 この相互作用は、OCP1 がフィコビリソーム上で赤色状態で二量体化するために使用するものと同じ疎水性表面を利用します 29。 FRPは、結合の会合定数をダウンシフトし、OCP1のこの二量体界面と競合することによって回復を加速することにより、フィコビリソームからのOCP1Rの分離を促進すると理論化されている(参考文献27)。 この二量体界面にとって重要であることが示されている残基と電荷は、私たちの祖先のOCPにも存在しており（拡張データ図3a）、FRPがすでにAncOCPallと相互作用できる理由を潜在的に説明しています。 この仮説を 2 つの方法で検証しました。まず、AncOCPall の CTD の AlphaFold2 モデルを推論し、その表面を OCP1 の CTD と比較しました。 AncOCPall は、OCP1 と同じ疎水性表面を持ち、実質的にすべての界面部位または電荷が 2 つのタンパク質間で同一です。 AlphaFold2はさらに、AncOCPallのこの表面とFRPの間の相互作用を予測します（図4eおよび拡張データ図9b〜e、g）。 第二に、このモデルはさらに、赤色状態での二量体化がすべての OCP の祖先の特徴であることを示しています。 これをテストするために、Native PAGE を使用して、祖先の OCP も活性化された赤色の形で二量体化するかどうかを理解しました。 我々の予測と一致して、活性化により、AncOCPallR および AncOCP1R のホモ二量体とサイズが一致した複合体の形成が引き起こされます。 AncOCP1&2 では赤色二量体は検出されませんでしたが、これはおそらく、ゲル内で赤色の形態を維持することが技術的に妨げられる非常に速い回復時間のためです (図 4f)。

まとめると、これは、FRP によって利用された結合表面が、FRP がシアノバクテリア系に補充される前から、すべての OCP の LCA にすでに存在していた、赤色型の OCP の古代の二量体界面であることを示しています。

OCPx パラログは FRP の影響を受けなくなりました 16,30。 AncOCPall と OCPx の間の根底にある構造変化を特定するために、Gloeobacter kilaueensis JS1 からの現存する OCPx の CTD との相互作用予測を繰り返しました。 AlphaFold2は、潜在的な界面の保存されたセリンをAncOCPallの祖先チロシンに戻さない限り、FR​​PとこのOCPxの間の相互作用界面を予測できませんでした（拡張データ図9h、i）。 これは、OCP タンパク質が FRP との相互作用を可能にする構造状態の内外を行き来していることを示唆しています。

なぜ一部の FRPL だけが OCP1 の光変換からの回復を促進するのかという構造的原因を理解するために、最終的に異なる FRPL の配列を比較しました。 AlphaFold2 モデルでは、Synechocystis sp. の FRP のフェニルアラニン 76、リジン 102、ロイシン 106 が異なります。 PCC 6803 は OCP1 と接続しています。 ほとんどの FRPL には 3 つの状態がすべて含まれるわけではありませんが、これらの状態のうち 1 つまたは 2 つが含まれる場合もあります。 例えば、Ｐ．ボルボリＦＲＰＬはフェニルアラニンを有するが、１０２位にチロシン、１０６位にセリンを特徴とする（拡張データ図８ａ）。 他の FRPL にはリジンはありますが、フェニルアラニンまたはロイシンがありません。 これは、OCP1 との相互作用にとって重要な状態が FRPL 系統発生を個別に行き来することを示しています。 3 つの状態すべてが、δ-プロテオバクテリアおよびシアノバクテリアに向かう系統に沿った FRPL 内でのみ一緒に出現しました。 シアノバクテリアへの HGT が完全な適合性のこの狭い範囲内で正確に起こったことは注目に値します。

今回、我々はシアノバクテリアの光防御システムにおけるアロステリック相互作用の進化を再構築した。 OCP の初期進化に関するこれまでの研究 13,16 と合わせて、浮かび上がった図は、進化的改変の注目に値する例です。31 OCP は、光スイッチング可能なタンパク質を作成するために柔軟なリンカーのみを必要とする遺伝子融合イベントによって作成された可能性が最も高いです。 2 つの切り替え不可能なコンポーネントのうち 16. FRP の水平取得により、OCP1 の基底状態の回復をさらに変更することなくアロステリックに加速できる新しいコンポーネントが導入されました。 完全に機能する OCP1-FRP システムを作成するには、最初は非生産的だった CTD との相互作用を光回復の加速をもたらす相互作用に変換する OCP の置換のみが必要でした (図 5)。 OCP の祖先と比較して FRP の取得のタイミングを正確に測定することはできないため、これらの置換が FRP の取得前に起こったのか後から起こったのかはわかりません。 もしそれらが以前に起こっていたら、FRPが水平に獲得された瞬間に、OCP1とFRPの間の調節的相互作用は完全に機能していたであろう。 FRP のもう 1 つの既知の機能は、OCPR とフィコビリソームの結合平衡定数をシフトさせることにより、フィコビリソームからの OCP1 の分離を促進することです 15。 この側面は私たちの研究では調査されていませんでしたが、祖先のOCPR二量体に結合する競合的なFRPもフィコビリソームからの分離を促進するか、少なくともフィコビリソームへの結合を妨げる可能性があり、事実上、潜在的な祖先の調節様式を生成する可能性があると考えられます。 FRPはシアノバクテリアに初めて出現した瞬間から機能し始めました。

強光照射により閉じたオレンジ色から開いた赤色状態に構造変化する最初の光スイッチ可能なOCPは、リンカー付加を介した祖先HCP（AncHCP）と祖先CTD様ホモログ（AncCTDH）の融合イベントで形成されました16 。 FRP 様タンパク質 (FRPL) は、祖先 OCP の潜在的な結合界面がすでに偶然に進化した後、無関係のラン藻系に水平移動 (HGT) されました。 FRP は、OCPR の保存された CTD 二量体化界面を利用して、OCP1 の光変換からの回復を強力に加速します。 ここで説明のためにのみ使用されている OCP 構造は、PDB ID 3MG1 (参照 58) です。

残る疑問の 1 つは、そもそもなぜ FRP がシアノバクテリアの光防御システムに組み込まれたのかということです。 FRP が採用される前に存在していた OCP は、自動的に迅速に回復できます。 なぜこの機能システムが複雑になるのでしょうか? 我々は、想定される 2 つの適応的利点を認識しています。まず、OCP1 と FRP の相互作用は、シアノバクテリア細胞の急速に変化する光領域におけるエネルギー使用のより高度な制御を提供する可能性があります 13。 FRP を使用しない OCP 媒介光保護システムは、メッセンジャー RNA 転写物のレベルでしか制御できず、ストレスの多い光条件から通常の光条件に戻る際にゆっくりとしか作用しませんが、FRP による制御により、より迅速な翻訳後制御が可能になる可能性があります 32。 第二に、それは強い光条件下で優れた光保護を提供する可能性があります。OCP2 および OCPx パラログは非常に早く回復するため、室温で赤色の形態を安定して蓄積するのに苦労します 13。 OCP1 のより安定した赤色状態は、大量のアクティブな OCPR が必要な場合に役立つ可能性がありますが、この高い安定性は単独で回復できないという犠牲を払っている可能性があります。 このシナリオでは、FRP の採用により、最終的により効率的な光防御メカニズムの進化が可能になったでしょう。 しかし、この相互作用は、単純に失うことが難しくなった非適応的な複雑さの一例である可能性もあります 33: FRP の獲得により、OCP1 は自力で効率的に回復する方法を「忘れる」ことができた可能性があります。 この機能を失ってしまえば、FRP は OCP1 の完全な機能に不可欠なものになっていたでしょう。

Desulfobacteraceae 種由来の FRPL とシアノバクテリア OCP の特異的な適合性は完全に偶然です。なぜなら、このタンパク質は OCP を含まないゲノムで進化したからです。 これは、高度に相補的なタンパク質表面が完全に偶然に進化する可能性があり、そのような最初の偶然の相互作用が生物の生物学に組み込まれる可能性があることを証明しています。 したがって、私たちの研究は、一部または多くのタンパク質間相互作用が直接的な自然選択の作用なしに最初に生成される可能性を高めています。 実際、生物は、水平移動、細胞局在の変化、または時空間的発現パターンの変化により、タンパク質が偶然適合する表面と結合するときに生じる、実質的に完全に形成された相互作用にさらされている可能性があります。 自然選択は、このプールから有害なものを一掃し、有用なものを修正し、無害なものを無視するでしょう。

シアノバクテリア OCP タンパク質の系統樹を推測するために、Muzzopappa et al.16 の OCP データセットを使用し、MUSCLE (v .3.8.31）34． シアノバクテリアの CTD 様相同体タンパク質 (CTDH) またはシアノバクテリアの HCP のいずれかの配列をそれぞれのアウトグループとして追加しました。 アラインメントは手動で修正され、系統特異的な挿入に対応する部位と重複した配列が削除されました。 完全なアライメントは補足データ 1 にあります。PROTGAMMAAUTO モードで RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10)35 を使用して、アミノ酸進化の最適モデルを特定しました。これは、改訂された Jones-Taylor-Thornton 置換行列 (JTTDCMut) でした。 )36 は、サイト間のレート変動の経験的な基本周波数とガンマ分布を示します。 SPR ムーブを備えた PhyML (v.3.1)37 を使用して、CTDH または HCP シーケンスのいずれかを含む 2 つの ML 系統を推論し、それらのシーケンスのいずれかとツリー上のすべての OCP シーケンスの間にツリーをルート化しました。 2 つの系統発生は基本的に同じトポロジーを示しますが、割り当てられていないグレード A が HCP アウトグループ ツリー上で最初に分岐しています (拡張データ図 2)。 初期分岐シアノバクテリアとして知られるグロエオバクテリア 18、19、20、21 は OCPx のみを特徴とし、割り当てられていないグレードの OCP 相同体を持たないため、さらなる分析のために CTDH アウトグループ ツリーを使用しました (拡張データ図 1)。 各トポロジの堅牢性は、100 回のノンパラメトリック ブートストラップを実行し、さらに PhyML で aLRT 統計を計算することによってテストされました。 図 1b と拡張データ図 1 に示すように、祖先 OCP シーケンスは、PAML (v.4.9)38 の CodeML モジュールのマージナル再構築と JTTDCMut 置換モデルを使用して、CTDH アウトグループ ツリー上の内部ノードで再構築されました。 16 のガンマ カテゴリ。 祖先配列は節約ルールに従って切り取られ、選択されたすべての部位で最も高い事後確率 (PP) を持つ状態が含まれています。 再構成されたすべてのタンパク質の平均 PP 値は、拡張データ図 3b ～ e に示されています。 再構築されたすべての祖先の「altAll」代替シーケンスは、PP > 0.20 の場合は 2 番目に高い PP を持つ状態を構成し、それ以外の場合は ML 状態を構成します。

FRP（L）系統樹（図2a）については、2022年2月23日にオンラインBLASTP39を使用してアミノ酸配列を収集し、Synechocystis sp.のFRPアミノ酸配列を収集しました。 クエリとして PCC 6803 (SYNY3)。 FRPL 配列を特異的に見つけるために、シアノバクテリア (taxid:1117) を除外し、SYNY3 FRP に対して検索を繰り返し、続いて P. borbari FRPL に対して検索を繰り返すか、シアノバクテリア以外の分類群で明示的に検索しました。 さらに、Global Microbial Gene Catalog (GMGC、v.1.0)40 からのメタゲノム配列を追加しました。 配列は MUSCLE (v.3.8.31) とアラインメントされました。 アラインメントは手動で修正され、系統特異的な挿入に対応する部位と重複した配列が除去されました。 完全なアライメントは補足データ 1 にあります。我々は、Akaike 情報量基準を使用する PROTGAMMAAUTO モードで RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) を使用し、アミノ酸進化の最適モデル (Le-Gascuel 置換行列 41) を特定しました。固定の基本周波数とサイト間のレート変動のガンマ分布を使用します。 私たちは ML 系統発生を推論し、100 回のノンパラメトリック ブートストラップを実行することでトポロジの堅牢性をテストしました。 TBE は BOOSTER Web ツール 42 を使用して計算されました。 さらに、aLRT 統計は PhyML (v.3.1) を使用して計算されました。 この樹はFRPLグループのアシドバクテリアとプロテオバクテリアの間に根を下ろしており、祖先デルタプロテオバクテリアから祖先シアノバクテリアへのHGTを示唆しています。 完全なツリーは補足図1にあります。祖先FRPLおよび祖先FRPシーケンス（それぞれFRPLpreHGTおよびFRPpostHGT）は、Le- Gascuel 置換行列 (LG) モデルと 16 のガンマ カテゴリ。 ギャップは節約を使用して割り当てられました。 私たちが復活させた祖先については、各部位で最も高い PP を持つアミノ酸の状態を選択しました。 再構成されたタンパク質の平均 PP は拡張データ図 8b、c にあります。

遺伝子ツリーと種ツリーの照合のために、我々は、120 個の単一コピーのセットとともにゲノム分類データベース (GTDB) 43 にも寄託されている別個の細菌株に確実に割り当てられる可能性のある FRP(L) ツリー上のすべての配列を特定しました。 BLASTP39を使用したマーカータンパク質配列。 これらの整列され連結されたアミノ酸配列を使用して、IQ-Tree 2 (v.2.2)44 (-m LG、-b 100、-alrt 1,000) を使用して ML 系統樹を推定し、上記のように酸性細菌で根を張りました。 したがって、対応する種の FRP および FRPL 配列を含む遺伝子ツリーを推論し、このサブセットに対して 100 回のノンパラメトリック ブートストラップを実行しました。 調整は、ALE45 の ALEml_undated を使用した ML 推定と根のある種の系統発生、および FRP(L) ブートストラップ ツリーを入力として使用して実行されました。 調整されたツリーと ALE 出力はソース データに保存されます。

代替祖先 FRPL 配列と代替祖先 FRP 配列 (それぞれ altFRPLpreHGT と altFRPpostHGT) を再構築するために、合計でより少ない配列を使用した初期アライメントを使用しました。 完全なアライメントは補足データ1にあります。拡張データ図8eに示すように、100のノンパラメトリックブートストラップを含むML系統樹が推論され、代替祖先FRPLおよび代替祖先FRP配列がそのツリーの内部ノードでそれに応じて再構築されました。補足図2。Le-Gascuel置換行列置換モデルと16のガンマカテゴリを使用したPAML（v.4.9）のCodeMLモジュールの周辺再構築を使用しています。 TBE は BOOSTER Web ツールを使用して計算されました。 代替祖先配列は倹約ルールに従って切り取られ、選択されたすべての側で最も高い PP を持つ状態を含みます。 再構成されたタンパク質の平均 PP は拡張データ図 8f、g にあります。

OCP 含有シアノバクテリアの系統樹種ツリーについて、我々は、120 個のシングル コピー マーカータンパク質配列のセットとともに GTDB にも寄託されている別個のシアノバクテリア株に確実に割り当てられる可能性のある、OCP ツリー上のすべての配列を同定しました。 アウトグループとして、密接に関連したマラインバクテリアの配列セットと、より遠縁に関連した Chloroflexota 種のセットを追加しました。 これらの連結されたアミノ酸配列を使用して整列し、PROTGAMMAAUTO モードの RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) を使用して系統樹を推論し、赤池情報量基準を使用してアミノ酸進化の最適モデルを特定しました。は、経験的な基本周波数とサイトの速度変動間のガンマ分布を備えた Le-Gascuel 置換行列 41 でした。 私たちは ML 系統発生を推論し、100 回のノンパラメトリック ブートストラップを実行することでトポロジの堅牢性をテストしました。 我々は、シアノバクテリアとアウトグループの間にツリーを根付けし、BLASTP および tBLASTn39 ヒットに基づいて、対応するゲノム内の frp および ocp 遺伝子の出現をツリーの隣にマッピングしました (拡張データ図 6)。 特定の OCP 配列の OCP パラログ グループへの割り当ては、OCP ツリー上の翻訳されたアミノ酸配列の位置に基づきます (拡張データ図 1)。

祖先OCP、Synechocystis sp.からの現存するOCP1のDNA配列。 PCC 6803 (SYNY3) および FRP (SYNY3) は、大腸菌での発現用にコドンが最適化され、Genscript Biotech または Life Technologies (GeneArt) によって合成されました。 合成された構築物は、特定のヒューマン ライノウイルス (HRV) 3 C プロテアーゼ切断部位 (LEVLFQ/GP) および N の 6xHis タグをコードする修飾 pRSFDuet-1 ベクター (Merck Millipore) にクローニングするために、BamHI および NotI 切断部位に隣接しました。末端（得られたプラスミドはｐＲＳＦＤｕｅｔＭと呼ばれる）。 切断後、すべての構築物は GPDPATM で始まりました。 現存する FRP (SYNY3 遺伝子 slr1964) を発現させるために、pRSFDuetM-FRP ベクターを大腸菌 BL21 (DE3) (New England Biolabs) に形質転換し、Luria-Bertani (LB) 培地 (1) で 37 °C で一晩増殖させました。 ％トリプトン、１％ＮａＣｌ、０．５％酵母エキス、ｐＨ７．０）、カナマイシン（Ｋａｎ、５０μｇ ｍｌ−１）を添加した。 翌日、1 l の LB + Kan に 10 ml の一晩培養物を接種し、光学密度 (OD600nm) が 0.6 ～ 0.8 になるまで 37 °C でインキュベートし、その後 0.5 mM イソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシド ( IPTG) を使用し、振盪インキュベーター内で 30 °C で 24 時間増殖させました。 細胞を10,000gで10分間収集し、使用するまで-20℃で保存しました。 OCP（現存OCP1、SYNY3遺伝子slr1963および祖先OCP）の発現のために、対応するpRSFDuetM-OCPxx構築物を、p25crtOプラスミドを有するエキネノン産生大腸菌BL21（DE3）に形質転換した。 発現は、クロラムフェニコール (34 μg ml-1) および Kan (50 μg ml-1) を補充した LB 1 l で実行し、これに 10 ml の一晩培養物を接種し、37 °C の振盪インキュベーターで増殖させました。 OD600nm = 0.6 ～ 0.8 になるまで C。 0.5 mM IPTGで誘導した後、細胞を25℃で72時間インキュベートし、最後に10,000gで10分間収集し、使用するまで-20℃で保存しました。 精製のために、凍結細胞ペレットを、100 mg のリゾチーム (Ovobest) およびプロテアーゼ阻害剤 (1 mM ベンズアミジン、 1 mM ε-アミノ-カプロン酸)。 細胞溶解は、FrenchPress (G. Heinemann) を使用して 18,000 psi で 3 サイクル実行しました。 その後、細胞破片を4℃、18,000gで15分間ペレット化しました。 蠕動ポンプを使用して、上清を5 mlのCo2+-HiTrap Talon粗製カラム(Cytiva)にロードした。 溶出は、総質量比 500:1 (タンパク質対プロテアーゼ) で HRV 3C プロテアーゼを補充したイミダゾール含有緩衝液 (1× PBS + 350 mM イミダゾール、pH 7.4) で実行し、3C プロテアーゼ中 4 °C で透析しました。緩衝液（２０ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ８．５）で１８時間培養した。 タンパク質溶液を Co2+-HiTrap Talon 粗製カラムに再ロードし、今度はフロースルーを収集しました。 FRPの場合、研磨のためにSECによって精製を実行しましたが、OCPの精製はアポタンパク質を除去するために疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）によって継続されました。 収集したOCPフロースルーを、HIC緩衝液(500mM (NH4)2SO4、100mM尿素、5mMリン酸塩、pH7.5)中で4℃で一晩透析した。 HIC は、自動 Azura FPLC システム (Knauer) の HiPrepTM 16/10 Phenyl HP カラム (Cytiva) で実行されました。 タンパク質は親水性緩衝液（100 mM 尿素、5 mM リン酸、pH 7.5）で溶出しました。 カロテノイドに富むタンパク質画分を、SEC 用の 10 kDa 分子量カットオフ (MWCO) 遠心フィルターユニット (Pall Corporation) を使用して濃縮しました。 FRP は 3 kDa MWCO 遠心フィルターユニットで濃縮されました。 次に、各濃縮タンパク質溶液 500 μl を SuperdexTM 200 Increase 10/300 カラム (Cytiva) にロードし、1× PBS で溶出しました。 タンパク質は使用するまで -80 °C で保存されました。

現存する FRPL、祖先 FRP、および祖先 FRPL タンパク質をコードするコドン最適化配列は、Integrated DNA Technologies (IDT) または Twist Biosciences から入手しました。 これらを、Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) を使用して、N または C 末端 6xHis タグを含む pET-LIC ベクターにクローン化しました。 使用したオリゴヌクレオチドを補足表 1に示します。正しいアセンブリは、Sanger Sequencing (Microsynth) によって検証されました。 プラスミドを大腸菌BL21(DE3)(Invitrogen)に形質転換した。 タンパク質の過剰生産のために、カルベニシリン (Carb) (100 μg ml-1) を補充した LB 50 ml に、新鮮な LB + Carb プレートからの単一コロニーを接種し、振盪インキュベーター内で 37 °C で一晩増殖させました。 500 ml の LB + Carb の 6 ロットに OD600nm = 0.01 で一晩培養したものを接種し、およそ 2.5 時間で OD600nm = 0.6 ～ 0.8 まで増殖させました。 タンパク質の過剰産生は 1 mM IPTG で誘導されました。 4 時間後、細胞を 4,392 g、4 °C で 20 分間収集し、細胞ペレットを使用するまで -20 °C で保管しました。 精製のために、細胞を35mlの緩衝液A(300mM NaCl、20mM Tris、20mMイミダゾール、5mM β-メルカプトエタノール、pH 8.0)に再懸濁し、cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (Roche) 1錠を加えた。 細胞を13,000 psiのLM10マイクロフルイダイザー(Microfluidics)中で2回破壊した。 29,930gで30分間遠心分離することによってライセートを清澄化し、0.45μmシリンジフィルターに通し、次いで5mlのBio-Scale Mini Nuvia Ni充填IMACカートリッジ(BioRad)にロードした。 ２５ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した後、２０ｍｌにわたる緩衝液Ｂ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス、５００ｍＭ イミダゾール、５ｍＭ β－メルカプトエタノール、ｐＨ８．０）の０から１００％までの直線勾配でタンパク質を溶出した。 NGC システム (BioRad)。 タンパク質を含む画分を社内でキャストした 15% SDS ゲルで確認し、HiLoad 26/600 Superdex カラム (Cytiva) を使用した SEC 用に SEC バッファー (200 mM NaCl、20 mM KCl、20 mM HEPES、pH 7.5) にプールしました。 ）NGCシステムでは。 タンパク質を含む画分の純度は社内でキャストした 15% SDS ゲルで確認し、MWCO 3 kDa の Amicon Ultra 遠心フィルター ユニット (Millipore) を使用して 2,000 g で濃縮するためにプールしました。 タンパク質は使用するまで -20 °C で保存されました。

OCP ホロタンパク質のカロテノイド含有量を分析するために、50 μl の濃縮タンパク質溶液を 1 ml のアセトンと混合し、4 °C で最大速度で遠心分離して、沈殿したタンパク質をスピンダウンしました。 黄色がかった上清を、アセトンが完全に蒸発してカロテノイドが赤色の結晶として沈殿するまで、遠心真空濃縮器（エッペンドルフ）中で３０℃で蒸発させた。 残った水溶液を除去し、赤色カロテノイド結晶を50μlのアセトンに再溶解した。 カロテノイドに富む溶液をサンプルバイアルに移し、Accucore C30 カラム (Thermo Fisher Scientific、250 × 2.1 mm、粒子サイズ 2.6 μm、細孔サイズ 150 Å) を備えた UFLC NexeraX2 システム (島津製作所) に配置しました。 移動相溶離液として、バッファー A (メタノール対水、95:5) およびバッファー B (メタノール対 THF、7:3) を次のプロトコルで使用しました: 0 ～ 4.3 分 0% のバッファー B、4.3 ～ 8.6 分直線バッファー B の 0 ～ 100% の勾配、8.6 ～ 15.6 分、バッファー B の 100%、15.6 ～ 20.1 分、バッファー B の 0%、0.4 ml min-1 の一定流量。 溶出されたカロテノイドは、特定のカロテノイド種と溶出時間を相関させる質量分析法、および薄層クロマトグラフィーおよび参照サンプルとの比較によって検証されました。

吸収スペクトルは、ファイバーを介して重水素タングステン光源 (Sarspec) およびキュベットホルダー (CVH100、Thorlabs) に接続された Maya2000Pro 分光計 (Ocean Optics) で記録されました。 OCP/FRP反応速度分析では、一定撹拌装置qpod2e（Quantum Northwest）を備えた温度制御キュベットホルダーをCCS100/M分光計（Thorlabs）およびSLS201L/Mタングステン光源（Thorlabs）にファイバー接続しました。 化学線による照明には、455 nm で最大発光を行う 3 W 発光ダイオード (Avonec) を使用しました。 異なるOCPO（異なる現生または祖先のFRP、現生または祖先のFRPLとさまざまなモル比で混合、または単独）を、少なくとも3分30秒間、またはプラトーになるまで青色光を照射することにより、赤色状態（OCPR）に光スイッチしました。に達し、青色光源を消した後、550 nm で光回復が常に追跡されました。 回復時定数 (τ) は、OCPR から OCPO への逆変換の緩和曲線を単指数減衰関数でフィッティングすることによって決定され、3 つの独立した反復の標準偏差 (sd) が計算されました。

遠紫外円二色性分光法を使用して、溶液中で異種生成された P. borbari FRPL (PbFRPL) の二次構造を評価しました。 タンパク質を円二色性緩衝液（100 mM NaF、10 mM Na2HPO4/NaH2PO4、pH 7.5）でおよそ 50 μg ml-1 の濃度に希釈し、JASCO J-810 を使用して室温で 0.1 cm キュベットで測定しました。分光偏光計 (Jacso) を 0.2 nm のスキャンステップで 190 ～ 240 nm の範囲で測定します。 3 つの連続したスペクトルが記録され、ベースラインが補正され、平均されました。

P. ボルボリ由来の FRPL タンパク質サンプル (PbFRPL) を -20 °C で保存した後、Pierce タンパク質濃縮装置 (Thermo Fisher) を使用して複数回の濃縮と希釈によって 200 mM 酢酸アンモニウム (pH 6.8) に緩衝液交換しました。 次に、測定の直前にサンプルを 4 μM (モノマー) に希釈しました。 データは、ソース温度 100 °C、キャピラリー電圧 1.2 kV の陽イオン モードで動作する Q Exactive 質量分析計 (ThermoFisher Scientific) で社内の金メッキキャピラリーを使用して収集されました。 小さなイオン付加物の解離を助けるために、ソース内トラップを -100 V に設定しました。 装置全体のイオン転送光学系と電圧勾配は、理想的な透過を実現するために最適化されました。 スペクトルは 10 回のマイクロスキャンで取得され、過渡時間 64 ms で S/N 比が向上しました。これは、m/z = 200 での分解能 17,500、AGC ターゲット 1.0 × 106 に相当します。ノイズしきい値パラメーターは次のとおりです。 3 に設定し、使用したスキャン範囲は 350 ～ 8,000 m/z でした。

P. ボルボリ FRPL (PbFRPL) の結晶化は、等量のタンパク質溶液と沈殿溶液からなる 2 μl 液滴中で、20 °C でハンギング ドロップ法によって実行されました。 PbFRPL は、0.2 M Li2SO4、0.1 M CHES、pH 9.5、および 1.4 M 酒石酸ナトリウム:カリウム中で 20 日以内に 119 μM で結晶化しました。 データ収集前に、凍結保護剤を使用せずに結晶を液体窒素中で急速冷凍しました。 シンクロトロン データは、ハンブルクの欧州分子生物学研究所 (EMBL) が運営する PETRA III ストレージ リング (ドイツ エレクトロネン シンクロトロン) 46 の P13 ビームラインで極低温条件下で収集されました。 データは XDS で統合およびスケーリングされ、XSCALE47 とマージされました。 構造は、PHASER48 による分子置換によって決定され、COOT49 で手動で構築され、PHENIX50 で精製されました。 分子置換による構造決定には、Synechocystis sp. 由来の FRP の結晶構造が使用されます。 PCC 6803 (PDB ID 4JDX、参考文献 25) を検索モデルとして使用しました。 PbFRPL の最終構造は、アクセッション番号 8AG8 で RCSB PDB にアップロードされました。 データは PyMol (v.2.4.0)51 を使用してレンダリングおよび視覚化されました。

数ラウンドの培養後、我々は、培養中のfrpl遺伝子の損失（すべてのモデル生物にFRPLが存在しないことの考えられる説明）、プラスミドの局在（HGTを促進する可能性がある）、またはサンプルの汚染を除外するために、P. borboloriの全ゲノムを再配列した。しかし、ゲノムはサイズが5.34MBの単一の環状染色体であり、frpl遺伝子の1コピーを伴うが、OCP、HCP、またはCTDH相同体を含まないことが判明した（拡張データ図7d）。 定常期の P. ボルボリのゲノム DNA は、製造元のガイドラインに従って NucleoBond HMW DNA キット (Macherey-Nagel) を使用し、細胞溶解にはリゾチーム (最終濃度 1 mg ml-1) を 37 °C で 1 時間使用して取得しました。 2 mlの10 mM Tris-HCl、pH 8.0。 DNA の品質と濃度は、二本鎖 DNA BR 試薬を使用して NanoDrop 8000 分光光度計と Qubit 3 蛍光光度計によって評価されました。 ライブラリーの調製は、メーカーのガイドラインに従って、ライゲーションシーケンシングキット SQK-LSK109 (Oxford Nanopore Technologies) を使用して実行されました。 ただし、DNA 剪断が適用されなかったため、プロトコールで予想されるモル濃度に一致するように入力 DNA を 5 倍に増加しました。 シーケンスは、「Flongle Flow Cell」（FLO-FLG001、セル化学 R9.4.1）を使用して、MinION Mk1B デバイスで 24 時間実行されました。 ナノポアデータは、ONT Guppy ベースコーリング ソフトウェアを使用してベースコールされました。 canu52 を使用してロングリードが組み立てられ、単一の環状染色体が得られました。 生のリードは国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) Sequence Read Archive に保管されており、BioProject no. でアクセスできます。 PRJNA865569 および BioSample アクセッション番号 SAMN30120905。

デルタプロテオバクテリウム P. ボルボリの型株 DSM17834 は、ドイツ微生物および細胞培養コレクション (ブラウンシュヴァイク、ドイツ) から購入しました。 PME培地（0.5％ペプトン、0.3％肉エキス、pH7.0）中28℃で好気的に培養し、生物学的三連の増殖曲線を記録した。 指数関数的成長時の生成時間 (G) は、式 \(G = \frac{{{{\Delta }}t}}{{3.3\log \left( {\frac{{{\mathrm{OD}) を使用して推定されました。 }_2}}{{{\mathrm{OD}}_1}}} \right)}}\)。

落射蛍光顕微鏡による in vivo 局在化のためのタンパク質融合は、200 bp の 5' 非翻訳領域を含む P. borbor の frpl 遺伝子の PCR 増幅と、N または C 末端の mVenus コード配列を持つ pSG1164 ベクターへの挿入によって生成されました。 Gibson Assembly Master Mix (NEB) を使用したフレーム内の「GGGGSL」リンカー シーケンス。 アセンブリが正しいことは、Sanger Sequencing (Microsynth) によって検証されました。 化学的にコンピテントな P. ボルボリは、当初緑膿菌用に開発された Irani と John53 によるプロトコールを次のように修正して調製しました。培地を PME に変更し、温度を 28 °C に下げました。 Irani および John53 の形質転換プロトコールに従って、プラスミドを P. borbor に形質転換しました。ただし、ヒートショック温度を 30 °C、培地を PME、増殖温度を 28 °C、カルベニシリン濃度を 100 μg ml-1 に変更しました。 コロニーが見えるまで、プレートを28℃で48時間インキュベートしました。

落射蛍光顕微鏡では、P. ボルボリ細胞を 28 °C、200 rpm で PME 培地中で「指数関数的増殖」の場合は OD600 = 0.6 まで、「飢餓」条件の場合は OD600 = 約 1.0 になるまで 2 日間増殖させました。 2枚のカバースリップ(12mm、Menzel)の間に100μlの融解アガロースを挟むことにより、細胞を1%アガロースパッド上に固定した。 次に、培養物 3 μl を円形のカバースリップ (25 mm、Marienfeld) に加え、アガロース パッドで固定しました。 広視野画像取得には、油浸対物レンズ (倍率 100 倍、開口数 1.45、alpha Plan-FLUAR、Carl Zeiss) を備えた Zeiss Observer A1 顕微鏡 (Carl Zeiss) を電荷結合素子カメラ (CoolSNAP EZ; Carl Zeiss) とともに使用しました。測光）および強度制御付きの HXP 120 メタルハライド蛍光照明。 落射蛍光顕微鏡では、緑色蛍光タンパク質フィルター セット (BrightLine 470/40、Beamsplitter 495、および Brightline 525/50) を使用しました。 サンプルは、細胞の中央面で 0.5 ～ 2 秒間照射されました。 全細胞積分蛍光を細胞ごとに測定し、バックグラウンド蛍光を補正しました。 画像の最終編集は ImageJ2/FIJI (v.1.52)54,55 で行われました。

分析 SEC は、1× PBS で平衡化した Superdex 75 Increase 3.2/300 カラム (Cytiva) を使用し、流速 0.1 ml min-1、総サンプル注入量 20 μl で実行しました。 青色光照明での測定では、455 nm で発光最大値を持つ 4 つの 3 W LED (Avonec) を SEC カラムの前の一定の距離で 20 cm ヒートシンクに取り付け、カラム上のサンプルを連続的に照明しました。 溶出プロファイルを追跡するために、280、496、および550 nmで吸収を記録しました。

AlphaFold2 タンパク質複合体モデルは、2022 年 5 月 20 日に ColabFold サーバー 56 を使用して、Synechocystis sp. 由来の OCP1 のいずれかの CTD を入力配列として使用して生成されました。 デフォルト設定の PCC 6803 (SYNY3) または AncOCPall および FRP (SYNY3)。 さらに、全長AncOCPallの構造を別途予測した。 2022年11月3日、我々はG. kilaueensis JS1由来のOCPx、またはそのOCPxのS264Y変異体（264位（SYNY3番号）のセリンがチロシンに変更された）のCTDを用いてFRP（SYNY3）を用いて分析を繰り返した。 モデル化された構造はソース データに保存されます。 データは PyMol (v.2.4.0)51 を使用してレンダリングおよび視覚化されました。

ネイティブ PAGE は、SDS を使用せず、Tris-グリシン緩衝系で 3 ～ 14% アクリルアミド濃度の社内キャスト グラジエント ゲルを使用して Mini-Protean Tetra Cell (Biorad) で実行し、ネイティブ タンパク質条件を取得しました。 スタッキングジェルは使用しませんでした。 電気泳動チャンバーは常に冷蔵庫で冷却され、ゲル内の OCP タンパク質を光スイッチするために 455 nm で発光最大値を持つ 4 つの 3 W LED (Avonec) で照明されました。 電圧を 240 分間常に 80 V に設定し、続いてさらに 100 分間 120 V に設定しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソース データは、マックス プランク協会 (エドモンド) のオープン リサーチ データ リポジトリ (https://doi.org/10.17617/3.44RHFZ) で入手できます。 結晶学データは、アクセッション番号 8AG8 で RCSB PDB から入手できます。 配列データは、BioProject PRJNA865569 の NCBI Sequence Read Archive で入手できます。

Peracchi, A. & Mozzarelli, A. アロステリーの探索と活用: モデル、進化、薬物ターゲティング。 ビオチム。 生物物理学。 Acta 1814、922–933 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ドーキンス、R. ありえない山に登る (ノートン、1996)。

ピライ、AS et al. ヘモグロビン進化の複雑さの起源。 ネイチャー 581、480–485 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

SM コイル、J. フローレス、ワシントン州リム 潜在アロステリーの活用により、MAP キナーゼ制御の新しいモードの進化が可能になります。 セル 154、875–887 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bridgham, JT、Carroll, SM & Thornton, JW 分子利用によるホルモン受容体の複雑性の進化。 サイエンス 312、97–101 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pillai, AS、Hochberg, GKA & Thornton, JW タンパク質の複雑性進化の単純なメカニズム。 タンパク質科学。 31、e4449 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Muzzopappa, F. & Kirilovsky, D. 光保護のために色を変える: オレンジ色のカロテノイドタンパク質。 トレンド植物科学。 25、92–104 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Slonimskiy, YB、Maksimov, EG & Sluchanko, NN 蛍光回復タンパク質: シアノバクテリアにおける光保護の強力だが十分に研究されていない調節因子。 フォトケム。 フォトビオール。 科学。 19、763–775 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kay Holt, T. & Krogmann, DW シアノバクテリア由来のカロテノイドタンパク質。 ビオチム。 生物物理学。 Acta 637、408–414 (1981)。

記事 Google Scholar

ウィルソン、A.ら。 シアノバクテリアにおけるフィコビリソーム関連のエネルギー散逸に関与する可溶性カロテノイドタンパク質。 植物細胞 18、992–1007 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィルソン、A.ら。 光強度センサーとして機能する光活性カロテノイドタンパク質。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 105、12075–12080 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gwizdala, M.、Wilson, A. & Kirilovsky, D. シネコシスティス PCC 6803 におけるオレンジ色のカロテノイドタンパク質によって媒介されるシアノバクテリアの光保護機構の in vitro 再構成。Plant Cell 23、2631–2643 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バオ、H.ら。 シアノバクテリアの光防御システムにおけるオレンジ色のカロテノイドタンパク質の追加ファミリー。 ナット。 Plants 3、17089 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Boulay, C.、Wilson, A.、D'Haene, S.、Kirilovsky, D. シアノバクテリアの OCP 関連光保護機構におけるアンテナ容量全体の回復に必要なタンパク質の同定。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 107、11620–11625 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thurotte, A. et al. シアノバクテリアの蛍光回復タンパク質には、FRP 相互作用に関与するオレンジ色のカロテノイドタンパク質のアミノ酸という 2 つの異なる活性があります。 ビオチム。 生物物理学。 アクタ、バイオエナジー。 1858、308–317 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Muzzopappa, F.、Wilson, A. & Kirilovsky, D. ドメイン間相互作用により、オレンジ色のカロテノイドタンパク質の分子進化が明らかになりました。 ナット。 Plants 5、1076–1086 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

メルニッキ、MR 他。 シアノバクテリアにおける可溶性カロテノイド結合タンパク質の新しいファミリーの構造、多様性、進化。 モル。 プラント 9、1379 ～ 1394 年 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schirrmeister, BE、Gugger, M. & Donoghue, PCJ シアノバクテリアと大酸化現象: 遺伝子と化石からの証拠。 古生物学 58、769–785 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

モヤ、A.ら。 シアノバクテリアにおけるゲノム配列の複雑さの漸進的な進化を推進。 科学。 議員 10、19073 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ムーア、KR 他シアノバクテリアの拡張されたリボソーム系統発生は、色素体の深い位置を裏付けています。 フロント。 微生物。 1612年10月（2019年）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Rahmatpour、N. et al. チラコイドを持たない新規分離株が、シアノバクテリアの進化における10億年の空白を埋めた。 カー。 バイオル。 31、2857–2867.e4 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kirilovsky, D. & Kerfeld, CA オレンジ色のカロテノイドタンパク質: 青緑色の光活性タンパク質。 フォトケム。 フォトビオール。 科学。 12、1135–1143 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジョージア州コールマンら。 根を張った系統発生は、初期の細菌の進化を解決します。 サイエンス 372、eabe0511 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vanparys、B.、Heylen、K.、Lebbe、L.、および de Vos、P. Pseudomonas peli sp. 11月およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｂｏｒｉ ｓｐ． 11 月、硝化接種材料から分離されました。 内部。 Ｊ．Ｓｙｓｔ． 56、1875–1881 (2006)。

CAS Google スカラー

サッター、M.ら。 FRP の結晶構造とシアノバクテリアにおける OCP 媒介光防御調節の活性部位の同定。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 110、10022–10027 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sluchanko, NN、Slonimskiy, YB、Moldenhauer, M.、Friedrich, T. & Maksimov, EG OCP の短い N 末端延長部分を削除すると、FRP 結合の主要な部位が明らかになります。 FEBSレター。 591、1667–1676 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sluchanko、NN et al. OCP-FRP タンパク質複合体トポロジーは、シアノバクテリアの高い耐光性を制御するメカニズムを示唆しています。 ナット。 共通。 9, 3869 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マサチューセッツ州ドミンゲス・マルティン 他集光状態および光保護状態のフィコビリソームの構造。 Nature 609、835–845 (2022)。

スロニムスキー、YB et al. 原始的なオレンジ色のカロテノイドタンパク質: 構造、光スイッチング活性、および進化の側面。 内部。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． マクロモル。 222、167–180 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジェイコブ、F. 進化といじくり。 サイエンス 196、1161–1166 (1977)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Petrescu, DI、Dilbeck, PL & Montgomery, BL シアノバクテリア Fremyella diplosiphon のオレンジ色のカロテノイドタンパク質をコードする遺伝子のホモログの環境調整。 フロント。 微生物。 12、819604 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Schulz, L.、Sendker, FL & Hochberg, GKA 非適応的な複雑さと生化学的機能。 カー。 意見。 構造体。 バイオル。 73、102339 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Edgar、RC MUSCLE: 高精度および高スループットの複数配列アライメント。 核酸研究所 32、1792–1797 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stamatakis, A. RAxML バージョン 8: 系統解析および大規模系統の事後解析のためのツール。 バイオインフォマティクス 30、1312–1313 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kosiol, C. & Goldman, N. デイホフ レート マトリックスのさまざまなバージョン。 モル。 バイオル。 進化。 22、193–199 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ギンドン、S.ら。 最尤系統を推定するための新しいアルゴリズムと方法: PhyML 3.0 のパフォーマンスの評価。 システム。 バイオル。 59、307–321 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yang、Z. PAML 4: 最尤法による系統解析。 モル。 バイオル。 進化。 24、1586–1591 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF、Gish, W.、Miller, W.、Myers, EW & Lipman, DJ 基本的なローカル アライメント検索ツール。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 215、403–410 (1990)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

メンデ、DR et al. proGenomes2: 原核生物ゲノムの正確かつ一貫した生息地、分類学的および機能的注釈を提供するための改良されたデータベース。 核酸研究所 48、D621–D625 (2020)。

CAS PubMed Google Scholar

Le, SQ および Gascuel, O. 改良された一般的なアミノ酸置換マトリックス。 モル。 バイオル。 進化。 25、1307–1320 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lemoine, F. et al. ビッグデータの時代におけるフェルゼンシュタインの系統発生的ブートストラップの更新。 ネイチャー 556、452–456 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パークス、DH et al. GTDB: 系統発生的に一貫性があり、ランクが正規化された完全なゲノムベースの分類法による、細菌および古細菌の多様性に関する継続的な国勢調査。 核酸研究所 50、D785–D794 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ミン、BQら。 IQ-TREE 2: ゲノム時代の系統推論のための新しいモデルと効率的な方法。 モル。 バイオル。 進化。 37、1530–1534 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szöllősi, GJ、Rosikiewicz, W.、Boussau, B.、Tannier, E. & Daubin, V. 調整された遺伝子ツリーの空間の効率的な探索。 システム。 バイオル。 62、901–912 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Cianci、M.ら。 P13 は、可変ビーム集束による高エネルギーと低エネルギーの位相調整のための低放射率 PETRA III リングの EMBL 高分子結晶学ビームラインです。 J. シンクロトロン Rad. 24、323–332 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

カブシュ、W. XDS。 アクタクリスタログル。 D. 66、125–132 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。 Ｊ．Ａｐｐｌ． クリスタロガー。 40、658–674 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: 分子グラフィックス用のモデル構築ツール。 アクタクリスタログル。 D. 60、2126–2132 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

アダムス、PD 他。 PHENIX: 高分子構造ソリューションのための包括的な Python ベースのシステム。 アクタクリスタログル。 D. 66、213–221 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

PyMOL 分子グラフィックス システム v.2.4.0 (Schrödinger, LLC)。

Koren, S. et al. Canu: 適応型 k-mer 重み付けとリピート分離による、スケーラブルで正確なロングリード アセンブリ。 ゲノム研究所 27、722–736 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irani、VR & Rowe、JJ Mg2+ と熱による緑膿菌 PAO1 の形質転換の促進。 BioTechniques 22、54–56 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コネチカット州ルーデンら。 ImageJ2: 次世代の科学画像データ用の ImageJ。 BMCバイオインフォーム。 18, 529 (2017)。

記事 Google Scholar

シンデリン、J.ら。 フィジー: 生物学的画像解析のためのオープンソース プラットフォーム。 ナット。 メソッド 9、676–682 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ミルディタ、M.ら。 ColabFold: タンパク質のフォールディングを誰でも利用できるようにします。 ナット。 方法 19、679–682 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng、L.ら。 シアノバクテリアのフィコビリソームにおけるエネルギー伝達機構の構造的洞察。 ナット。 共通。 12、5497 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィルソン、A.ら。 シアノバクテリアの光活性オレンジカロテノイドタンパク質における光保護の基礎となる構造決定因子。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 285、18364–18375 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

NS、SGG、GKAH はマックス プランク協会によってサポートされています。 AARR と D.Schindler は、MaxGENESYS プロジェクトの枠組みでマックス プランク協会から資金提供を受けています。 TF は、Deutsche Forschungsgemeinschaft による資金提供 (助成金番号 FR 1276/5-1 および FR 1276/6-1) と、Azura FPLC マシンに対する Einstein Foundation の助成に感謝します。 欧州連合 (ERC、EVOCATION、101040472) によって共同出資されています。 ただし、表明された見解や意見は著者のみのものであり、必ずしも欧州連合または欧州研究評議会の見解や意見を反映しているわけではありません。 欧州連合も認可当局もそれらに対して責任を負うことはできません。 PLG は、ドイツ連邦政府の支援 (助成金番号 GR1670/27-1) に感謝の意を表します。 JLPB と D.サマン。 Leverhulme Trust (助成金番号 RPG-2021-246) からの支援に感謝します。 オープンアクセスの目的で、JLPB は、この投稿から生じた著者受諾済み原稿バージョンに CC BY 公共著作権ライセンスを適用しました。 NN Tavraz (ベルリン工科大学) と C.-N に感謝します。 Mais (マールブルク大学) 研究室サポート。

マックス・プランク協会が提供するオープンアクセスの資金提供。

Niklas Steube、Marcus Moldenhauer などの著者も同様に貢献しました。

マックス・プランク陸生微生物学研究所、マールブルク、ドイツ

ニクラス・ストーベ、アダン・A・ラミレス・ロハス、スリラム・G・ガーグ、ダニエル・シンドラー、ゲオルク・KA・ホッホベルク

ベルリン工科大学化学研究所 PC14、ベルリン、ドイツ

マルクス・モルデンハウアー & トーマス・フリードリヒ

マールブルク大学化学科（マールブルク、ドイツ）

ポール・ウェイランド、アレクサンドラ・キルブ、ピーター・L・グローマン、ゲルト・バンゲ、ゲオルク・KA・ホッホベルク

合成微生物学センター (SYNMIKRO)、マールブルク、ドイツ

ポール・ウェイランド、アレクサンドラ・キルブ、ダニエル・シンドラー、ピーター・L・グローマン、ゲルト・バンゲ、ゲオルク・KA・ホッホベルク

オックスフォード大学化学科、オックスフォード、英国

ドミニク・サマン & ジャスティン LP ベネシュ

カブリナノサイエンス発見研究所、オックスフォード大学、オックスフォード、英国

ドミニク・サマン & ジャスティン LP ベネシュ

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NS、MM、TF、GKAH がプロジェクトを発案し、原稿執筆を監督しました。 NSは、P.ボルボリの系統発生学、祖先配列の再構築、タンパク質精製、円二色性分光法および遺伝子操作を実施した。 MM はタンパク質の精製、生物物理学的および生化学的な実験を実施しました。 PW と GB はタンパク質の結晶構造解析を実行し、データを解釈しました。 AK と PLG は落射蛍光顕微鏡検査を実施し、データを解釈しました。 D.Saman と JLPB はネイティブ質量分析を実行し、データを解釈しました。 AARR と D.Schindler は P. borbari の配列を決定し、データを分析しました。 SGG は系統樹の種ツリーを推論し、遺伝子ツリーと種ツリーの照合を実行しました。 NS、MM、TF、GKAH はすべてのデータを解釈しました。 著者全員が原稿執筆とディスカッションに貢献しました。

Thomas Friedrich または Georg KA Hochberg への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Ecology & Evolution は、この研究の査読に貢献してくれた Per Jemth と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ラベルされたノードに再構築された祖先タンパク質 (Anc)、およびアウトグループとしてシアノバクテリアの C 末端ドメイン様タンパク質 (CTDH) を含む OCP タンパク質の ML 系統発生 (黒枠の挿入)。 OCP パラログと祖先は、図 1b のように色分けされています。 さらに、OCP1 の最後の共通祖先 (conAncOCP1、灰色) (拡張データ図 3a+e、4d、h、l、p、t) のより保守的なシーケンスと、すべてのノードの代替の「altAll」祖先をテストしました。このツリー上にあります (拡張データ図 3a、5a ～ l)。 斜体の数字は、100 回の反復のフェルゼンシュタイン ブートストラップ確率 (FBP) です。 グレー数値は、尤度比検定値 (aLRT) の近似値です。 分岐の長さは、部位ごとの平均置換を表します。 グレーのアウトラインで挿入すると、その領域のブランチ トポロジが適切に表示される 3 倍のズームインになります。 補足データ 1 の基礎となる複数の配列アラインメント。

OCP タンパク質の ML 系統図は拡張データ図 1 と同様ですが、シアノバクテリアのらせん状カロテノイドタンパク質 (HCP、挿入) をアウトグループとして使用しています。 補足データ 1 の基礎となる複数の配列アラインメント。ここでは祖先は再構築されません。

a、Synechocystis sp.由来のOCP1の多重配列アラインメント。 再構築された祖先 OCP シーケンスとそれぞれの代替シーケンス (alt) を含む PCC 6803 (SYNY3)。 OCP1O16、OCP1R29の二量体化、OCP1の減速、FRP7との相互作用にとって重要な状態が示され、保存されている場合は赤、保存されていない場合は青で表示されます。 残基の番号付けは SYNY3 OCP1 に従います。 C 末端ドメイン (CTD)、リンカー、および N 末端ドメイン (NTD) 領域は、それに応じて標識されています。 本文に登場しない、より保守的な祖先 OCP1 (conAncOCP1) とその代替配列は灰色で表示されます。 は、再構成された配列ごとに 20 のビン カテゴリを使用した、サイトごとの事後確率 (pp) の分布です。平均とあいまいなサイトの数が表示されます。 2 番目に高い pp を持つ州の pp > 0.2 の場合、サイトは曖昧とみなされ、代替先祖の州に置き換えられました。

ad、祖先タンパク質精製の12 % SDS ポリアクリルアミドゲル。 l、溶解物。 フィート、流れてください。 ｗ、洗います。 e、溶出。 -彼の、彼のタグの切断後。 ｓｅ、サイズ排除クロマトグラフィー後。 精製を３回繰り返したが、同様の結果が得られた。 えー、祖先のOCPの不活性なオレンジと活性な赤色の状態のUV-Vis吸収スペクトル。 ip、Synechocystis sp.からの現存FRP（モル比5 OCP：1 FRP）または非存在下での祖先OCPの光変換からの回収。 PCC 6803 (SYNY3) をさまざまな温度で示します。 qt、SYNY3 FRP あり (赤) またはなし (黒) の光変換からの回復のアレニウス プロット。 uy、祖先OCPの光変換からの回復。単独、または異なる祖先FRPまたは祖先FRPLまたは現存するFRPLを使用した、シュードモナス・ボルボリ由来の異なるモル比で、20℃で示されています。3回の独立した複製のそれぞれの平均回復時定数（τ）および標準偏差。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。

ad、代替祖先タンパク質精製の 12 % SDS ポリアクリルアミドゲル。 l、溶解物。 フィート、流れてください。 ｗ、洗います。 e、溶出。 -彼の、彼のタグの切断後。 ｓｅ、サイズ排除クロマトグラフィー後。 精製を３回繰り返したが、同様の結果が得られた。 えー、代替祖先 OCP の不活性オレンジと活性レッド状態の UV-Vis 吸収スペクトル。 ｉ１、シネコシスティス種からの現存ＦＲＰあり（シアン）またはなし（黒）の代替祖先ＯＣＰの光変換からの回収。 20 °C での PCC 6803 と 3 つの独立した複製のそれぞれの平均回復時定数 (τ) および標準偏差。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。 altAncOCPall は写真でほとんど切り替えられません。

100 回の反復のフェルゼンシュタイン ブートストラップ確率 (FBP) による ML 種の系統発生を斜体で示します。 FRP および OCP パラログの出現は系統発生の隣にマッピングされます。 アスタリスクは、BLAST データベース内の複数の種のエントリを示します39。 感嘆符は、OCP1 を持ちながら FRP を欠いている唯一の株を示しています。 補足データ 1 の基礎となるアミノ酸配列のアラインメント。

a、h + i、P. borbor、Methylocaldum sp.、Desulfobacteriaceae (D)、および Chlorobi sp. の 15 % SDS ポリアクリルアミド ゲル。 (C) サイズ排除クロマトグラフィー後の FRPL。 精製を３回繰り返したが、同様の結果が得られた。 b、CDバッファー（灰色）中のP.ボルボリFRPL（黒色）の円二色性（CD）スペクトル。 c、P.ボルボリFRPLのネイティブ質量分析データ。 d、ナノポア配列統計。 e、平均値と標準偏差 (SD) を示した生物学的三重実験における P. ボルボリの増殖曲線、および指数関数的増殖中の世代時間 (G) の決定。 f、何も発現しない（WT）、mVenusのみ（mVenus）、またはN末端またはC末端mVenus融合を有するFRPL融合タンパク質を発現するP.ボルボリ株のエピ蛍光顕微鏡。 平均値と標準偏差を含む全細胞統合蛍光、明視野 (BF) 画像、GFP チャネル信号 (mVenus)、および両方のオーバーレイ (マージ) が表示されます。 赤い矢印は細胞極のシグナル焦点を指します。 スケール バーは 2 μm を表し、すべての画像に適用されます。 g、両側ウェルチ t 検定を実行して、平均全細胞積分蛍光を *** p < 0.001、** p = 0.013、ns、有意ではありません (p = 0.580)。 条件ごとに n = 28 セル。 ボックスはデータの四分位間値の下位から上位まで伸びており、中央値に線が引かれています。 ひげは、± 1.5 四分位範囲内のデータを表示します。 円は外れ値です。 j + k、Synechocystis sp.からのOCP1の光変換からの回復。 現存する FRPL を含む PCC 6803 を 20 °C で示し、3 つの独立した複製のそれぞれの平均回復時定数 (τ) および SD を示します。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。

a、Synechocystis sp.由来のFRPのアミノ酸配列アラインメント。 現存および再構築された祖先 FRPL および祖先 FRP を含む PCC 6803 (SYNY3)。 FRP におけるホモ二量体化および OCP1 との相互作用に重要な部位が指摘されており 7,8、保存されている場合は赤色、保存されていない場合は青色で表示されます。 番号はSYNY3 FRPに準じます。 補足図1 + 2の再構成のMLツリー。b + c、f + g、再構成された配列ごとに20のビンカテゴリーを備えたサイトごとの事後確率（pp）の分布（平均とpp > 0.2のあいまいなサイトの数） 2 番目に pp が高い州が表示されます。 d + h、サイズ排除クロマトグラフィー後の祖先タンパク質の 15 % SDS ポリアクリルアミドゲル。 精製を３回繰り返したが、同様の結果が得られた。 濃縮した、濃縮された。 e、示されたノードでの代替 (alt) 祖先の再構築に使用される根のない初期 FRP(L) 系統樹。 分岐の長さは、部位ごとの平均置換を表します。 補足図 2 の完全なツリー。HGT、水平遺伝子伝達。 TBE、転送ブートストラップの期待。 i + j、代替祖先 FRP (altFRPpostHGT) または代替祖先 FRPL (altFRPLpreHGT) による SYNY3 OCP1 の光変換からの回復。20 °C での異なるモル比で示されています。3 つの独立した複製のそれぞれの平均回復時定数 (τ) および標準偏差。 わかりやすくするために、代表的なデータセットを示しています。 そして、特定できません。

a + b、AlphaFold2モデルの残基ごとの信頼度推定値（pLDDT）を図4d + eに示します。 ｃ、シネコシスティス種由来のＦＲＰとの予測相互作用に関与するＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）内の示された残基を有する予測全長ＡｎｃＯＣＰａｌｌの信頼性。 ここで予測される AncOCPall のコンパクトなオレンジ色の N 末端伸長 (NTE、マゼンタ) によってブロックされる PCC 6803 (SYNY3) 。 NTD、N末端ドメイン。 d, AncOCPallとSYNY3 FRPの間のモデル化された相互作用の信頼度。 例: 予測整列エラー (PAE)。 h + i、Gloeobacter kilaueensis JS1 由来の OCPx の CTD の AlphaFold2 モデルは、264 位 (SYNY3 番号付け) のセリン (S) がチロシン (Y) に変更されない限り、予想される界面での SYNY3 FRP との相互作用を予測しません (実験データ 30 と一致します)。 )、AncOCPall の祖先の状態がここでオーバーレイでさらに表示されます。 挿入図は PAE を示します。

補足図。 1 ～ 3、表 1 および考察。

拡張データ図の基礎となる複数の配列アラインメント。 図１、２、６および補足図。 1と2。

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転載と許可

Steube, N.、Moldenhauer, M.、Weiland, P. 他偶然にも適合性のあるタンパク質表面が、シアノバクテリアの光防御におけるアロステリック制御のプライミングを引き起こした。 Nat Ecol Evol 7、756–767 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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受信日: 2022 年 9 月 5 日

受理日: 2023 年 2 月 21 日

公開日: 2023 年 4 月 3 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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