Huffmanela persica sp.の説明、分子同定および病理学的病変 11月 (線虫目: Trichosomoididae: Huffmanelinae) ダガートゥースパイクアナゴ Muraenesox cinereus より

Dec 30, 2023

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 182 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ハフマネラ モラベック属 (1987 年) (線虫綱、トリコソモイダ科、ハフマネリ亜科) は、海水魚と淡水魚の両方に感染する線虫のグループを表しており、この属のさまざまな種による感染の主な全体的な特徴は、内部に顕著な暗い斑点または痕跡が存在することです。寄生された組織。 この研究の目的は、新種の海洋種ハフマネラ (Huffmanela persica sp. nov.) の卵を形態学的および形態計測的に記述することであり、この卵は卵巣と胃の漿膜に黒い斑点の形で発見されました。ハモ (Muraenesox cinereus)。 この新種は、日本でこの宿主の筋肉組織から報告されている別の種であるハフマネラハモとは、卵の寸法、卵殻の特徴、標的器官の点で異なっている。 新種によって引き起こされる病変の分子同定と病理学的検査も報告されています。

さまざまな発育度の線虫の卵を感染組織（卵巣および胃の漿膜）から分離し、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を使用して調査しました。 異なる種特異的マーカー (小サブユニット リボソーム DNA、18S、大サブユニット リボソーム DNA、28S、内部転写スペーサー、ITS) が、新種の分子同定と系統学的研究に使用されました。 感染組織は病理学的調査のために緩衝ホルマリンで固定されました。

H. persica sp.の完全に発育した卵。 11月この宿主から以前に報告されたものとは、その測定値（サイズ、54～68 × 31～43 μm、極プラグ、6.4～9.7 × 8.4～12 μm、殻の厚さ、3.5～6.1 μm）と繊細な形状に基づいて区別されます。しかし、極栓を含む卵殻全体を覆う華やかな子宮層（UL）。 病理組織学的検査により、感染した魚の卵巣と胃の漿膜層に線維肉芽腫性炎症が存在することが判明した。 最尤法（ML）系統解析により、海洋起源の新種と以前に淡水宿主から収集されたハフマネラ種との間の姉妹関係が回復した。

本研究は、ハフマネラ属の硬骨魚類関連海洋種の分子的特徴付けと系統学的位置を報告した最初の研究である。 ハフマネラの名目上の母集団と名目上の母集団の包括的なリストも提供されます。

ハフマネラ症は、海洋および淡水環境に生息するさまざまな魚種で発生することが知られており、ハフマネラ モラベック属 (1987 年) (線虫目、旋毛虫上科、トリコソモイダ科、ハフマネリナ科) のメンバーによって引き起こされる寄生虫感染症です [1]。 現在までに、ハフマネラ属の名目上 23 種と約 12 種の無名種が記載または報告されていますが、そのほとんどは、まれに見つかる成虫を収集することなく、注目すべき卵 (一般に卵は同型とみなされます) の形態に基づいて区別されています [2] ]。 これまでに認識されていた多くの同属種は、世界の海洋生態系に分布する海産魚から収集されました。 しかし、ハフマネラの淡水種による感染は、米国ではセントラルキダ科とポエチリ科、ブラジルではテトラオドン科に属する特定の魚でのみ報告されている[3,4,5,6]。 端脚類の甲殻類 Hyalella は、Huffmanela の淡水個体群の生活環における実験的な中間宿主として機能します (Huffmanela huffmani、Moravec、1987) [7、8]。 ハフマネラの海洋種の生活環と生物学に関する情報は不足していますが、近縁な海洋起源の端脚類がおそらく中間宿主として機能していると考えられます [9]。 一般に、卵は中間宿主によって摂取され、次に終宿主としての魚によって摂取され、そこで幼虫線虫が成熟して成虫になります。 交尾後、成体の雌は種特有の組織内に多数の卵を産み、その後すぐに成体の線虫は消滅し始めます[3、10]。 卵は発育を続け、感染部位ではほとんどが肉眼で見える暗い斑点として現れます [11、12]。 雌成虫の移動の結果として魚の組織に沈着した卵に由来する黒く変色した斑点または痕跡の存在は、ハフマネラ感染の特徴である[13]。 組織生代寄生虫ハフマネラの卵および成体による腸管外感染は、多様な硬骨魚類および板鰓類の魚類で、主に皮膚、浮き袋、漿膜、腸間膜、筋肉、生殖腺および骨で記録されている[14、15]。

一般に、ハフマネラ症は野生の魚では深刻な問題ではありません。 それにもかかわらず、外部臓器および筋肉組織（肉）で観察された感染は、影響を受けた魚の市場性に悪影響を及ぼし、最終消費者による拒否につながる可能性があります[16]。 さらに、浮き袋で診断された感染は、この特定の器官の生理学的効率を低下させることが判明しました [5]。 ハフマネラ種に関連する卵は、人間から採取された便サンプルからも検出されています。 しかし、公衆衛生の観点からハフマネラ種の人獣共通感染症の可能性に関する報告は存在しない[17、18、19]。

本研究では、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いた寄生虫卵の形態計測および形態学的検査に基づいて、ハモハモ (Muraenesox cinereus) からの新種のハフマネラ (Huffmanela persica sp. nov.) を記載します。硬骨魚類に関連する海洋種であるハフマネラの 3 つの異なる遺伝マーカー (18S、28S、および ITS) に関連する分子配列データが我々の知るまでに時間がかかり、宿主組織における線虫の自然発生的な感染によって引き起こされる病理学的損傷が報告されています。

2021年1月中に、平均体長86.65±7.74cm（平均±SD）の合計20匹の獲れたての魚（M. cinereus）が、イラン、ブーシェフルのジル・アハク沖（北緯28度17分、東経51度13分）。 寄生虫感染を検出するために、魚とその臓器の肉眼検査と立体顕微鏡検査がそれぞれ実行されました。 一方、H. persica sp. の成体標本はありません。 11月内臓からこの線虫が回収され、卵巣と胃の漿膜（漿膜）が、雌線虫によって産着された識別可能な黒色の卵塊によって感染していることが判明した。 卵を含む感染組織を収集し、2 つの部分に分けました。 最初の部分は、形態学的検査および病理学的検査のために 10% 中性緩衝ホルマリン中に保存されました。 2 番目の部分は、分子分析および SEM 分析のために 70% エタノールに保存されました [15]。 同時に、固定されていない感染組織からメスを使って卵を掻き取り、湿式でマウントしてスライドガラスにカバーをかぶせ、線虫の幼虫のサイズを測定するためにホルマリンで固定する前に穏やかな圧力をかけた[10、20]。

卵の形態と形態計測を調査するために、感染組織内の卵塊を分離し、グリセロールで清澄し、グリセリンゼリー（一時的埋設の場合）またはカナダバルサム（永久埋設の場合）に封入した。 すべての測定は、複合顕微鏡 (Olympus BX-53) にインストールされたデジタル カメラ (Olympus SC50 CMOS) と統合された cellSens イメージング ソフトウェアを使用して実行されました。 本研究で考慮された卵の測定値と形態学的特徴（図1を参照）は、以前に記載されたものに従っていました[15、21、22、23、24]。 H. persica sp.の卵の構造を説明する。 11 月、2023 年にボンドとハフマンによって提案された新しい解剖学的および用語学の枠組みが採用されました [25]。 測定値は、マイクロメートル単位で範囲 (最小値～最大値) に続いて括弧内の平均 ± 標準偏差 (SD) で示されます。 線画は描画チューブを使用して作成されました。

Huffmanela persica sp.の進化した卵の図。 11月この研究で考慮された測定値を使用します。 極性プラグ突出およびUL（黒線）を含む全長。 極性プラグとUL（赤線）の突出を除いた全長。 ULを含む全幅（黄色の線）。 UL（水色の線）を除いた全幅。 UL（緑色の線）でのシェルの厚さ。 UL（白線）を除いたシェルの厚さ。 極プラグ幅（濃い青色の線）

70% エタノール (4 °C で保存) で固定した線虫の卵を慎重に分離し、70% アセトンに一晩移し、70 ～ 90% の範囲の上昇する一連のアセトン中で 10 分間隔で脱水し、続いて無水アセトンで 3 回脱水しました。 30分[15]。 続いて、サンプルを無水アセトンとヘキサメチルジシラザンの混合物（1:1 v/v）（HMDS、Sigma-Aldrich、ドイツ）で処理し、HMDS に（最終乾燥ステップとして）各 60 分間 3 回浸漬しました。 数時間自然乾燥させた後、両面粘着テープを使用して金属片に取り付け、サンプルコーター (Balzers SCD 050) で金の薄層 (4 nm) をスパッタリングし、卓上走査型電子顕微鏡で検査しました (日立TM-1000（加速電圧15kV）、高感度半導体BSE検出器を搭載。

ホルマリンで固定した感染組織を水ですすぎ、グレードの高いエタノールで脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンに含浸させました。 パラフィンに包埋された標本は、ミクロトーム (Microm HM 360 ミクロトーム、MICROM Laborgeräte GmbH、ヴァルドルフ、ドイツ) を使用して 4 μm の厚さに微細切片化され、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で二重染色され、スライドガラスにマウントされました [26]。 組織切片を光学顕微鏡を使用して検査し、画像を光学倍率5倍、10倍および100倍(Leica DM 2500)で撮影した。

70%エタノールに保存した感染組織から卵凝集体を取り出し、2mlエッペンドルフチューブに移し、ヌクレアーゼフリー水ですすぎ、9660×gで1分間遠心分離して回収した。 線虫の卵からのゲノム DNA は、DNeasy Blood and Tissue キットを製造元 (Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ) の指示に従って使用して抽出しました。 簡単に説明すると、180 μl の溶解バッファー ATL と 40 μl のプロテイナーゼ K (20 mg/ml) を、収集した卵を含む各チューブに加え、チューブを 15 秒間ボルテックスし、Eppendorf Thermomixer R (ハンブルク、ドイツ) 上で一晩インキュベートしました。 ）56℃で。 その後、200μlの溶解バッファーALを各チューブに添加し、56℃で10分間インキュベートした。 卵からの未溶解のキチン質物質を9660×gで30秒間の遠心分離によって沈殿させ、DNAを含む上清を新しい2mlエッペンドルフチューブに移した。 合計 200 μl の純粋なエタノールを加え、混合物を 2 ml コレクションチューブに入れた DNeasy Mini スピンカラムにピペットで移しました。 洗浄緩衝液AW1およびAW2を使用した2回の洗浄ステップの後、35μlの緩衝液AEを添加することによってゲノムDNAを1.5mlチューブ中に溶出した。 全 DNA も感染していない宿主組織から抽出され、ネガティブ コントロールとしてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 反応に組み込まれました。 抽出された DNA の濃度と純度は、NanoDrop 2000 (Thermo Scientific、米国) を使用して測定されました。 卵から精製された DNA の濃度は 1050 ng/μl であることが判明し、その後 PCR 反応に使用する前に 100 ng/μl に調整されました。 260/280 および 260/230 の吸光度比は、それぞれ 2.11 および 2.18 でした。 寄生虫の分子同定には 3 つの異なるマーカーが使用されました。 18S rDNA 遺伝子は、以前に記載されているように [27]、プライマー Nem_18S_F および Nem_18S_R を使用した PCR によって部分的に増幅されました。 28S rDNA の PCR 増幅は、プライマーセット D2A と D3B、および 28SF と 28SR を使用して実行されました [28、29]。 ITS1、5.8S遺伝子およびITS2を含むITS領域全体を、プライマーNC5およびNC2を使用するPCRによって増幅した[30]。 使用したプライマー配列を表 1 に示します。PCR 反応は、25 μl DreamTaq Green PCR マスター ミックス (Thermo Scientific)、2 μl 10 pmol/ul フォワードおよびリバース プライマー、1 μl 25 mM MgCl2 ( Thermo Scientific）、15 μl ヌクレアーゼフリー水および 5 μl 100 ng/μl DNA。 この研究で使用された PCR サイクリング条件は、以前の研究で最適化された条件です [27、28、29、30]。 PCR産物を1%アガロースゲルで確認し、ゲルから切り出し、製造業者(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)のプロトコールに従ってMinEluteゲル抽出キットを使用して精製した。 ITS 領域全体 (ITS1、5.8S、および ITS2) から増幅された精製 PCR 産物の配列決定が成功しなかったため、市販のキット (TOPO® TA Cloning® Kit、Invitrogen) を使用して pCR™4-TOPO® TA ベクターにクローニングしました。 、米国）。 得られた構築物をコンピテントセル (Invitrogen™ One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli) に形質転換し、形質転換体を 50 μg/ml カナマイシンを補充した Luria-Bertani (LB) 寒天培地にプレーティングしました。 次に、陽性クローンをコロニー PCR スクリーニングによって分析し、マニュアルに含まれるプロトコールに従って QIAprep Spin Miniprep Kit を使用してプラスミド DNA を単離しました。 精製された DNA およびプラスミドサンプルは、PCR 反応で使用したのと同じプライマーを使用して両方の方向で配列決定されました。 バーコード配列決定は、LGC Biosearch™ Technologies (LGC Genomics GmbH、ベルリン、ドイツ) の自動シーケンサー (ABI 3730 XL) を使用して実行されました。 各遺伝子に関連するコンセンサス配列を抽出するために、得られた配列ファイルをソフトウェア MEGA X を使用して整列させ、プログラム Chromas バージョン 2.6.6 によってチェックし、手動で組み立てました [31]。

標準ヌクレオチド BLAST (blastn) を使用して、ターゲット配列 (18S、28S、および ITS) を GenBank リポジトリに事前に登録されている配列データと比較しました。 トリコソモイダ科に属するさまざまな属の利用可能なすべての配列、ホール、1916 年、および旋毛虫上科の他の既知の科内の重要な属の種を表す配列データ、1907 年（カピラリ科ライリエット、1915 年; 旋毛虫科ワード、1907 年; 旋毛虫科ランサム） 、１９１１；およびＣｙｓｔｏｏｐｓｉｄａｅ Ｓｋｒｙａｂｉｎ、１９２３）は、ＧｅｎＢａｎｋから取得され、系統解析に含まれた（表２）［５、３２、３３］。 同様に、この研究で新たに生成された配列とほぼ同様の長さの配列のみが選択されました。 系統樹は、MEGA X ソフトウェアを使用した最尤法 (ML) 法によって (ハフマネラおよびその近縁分類群に関連する 28S rDNA および ITS 配列がまだ GenBank 配列データベースに登録されていないため) 得られた 18S rDNA データセットに基づいて構築されました。 34]。 複数のアライメントは、同じソフトウェアに実装された ClustalW を使用し、デフォルトのパラメーターで実行されました。 次いで、アライメントを（両端で）最短の配列長にトリミングし、最も適合するヌクレオチド置換モデルを選択した[35、36]。 ML 解析は、置換モデル K2 + G (ガンマ分布を備えたキムラ 2 パラメータ) に従って 1000 回のブートストラップ複製で実行されました。

タイプ終宿主：ダガートゥース・ハモ、ムラエネソックス・シネレウス（フォルスカル）、ウナギ目、ムラエネソシ科、採集日、2月

タイプ産地: イラン、ブーシェフル、ジル・アハク沖のペルシャ湾 (北緯 28 度 17 分、東経 51 度 13 分)。

感染部位：卵巣、胃漿膜（図2A）。 H. persica sp. の顕著な卵塊 11月感染した13匹すべての魚の卵巣で観察された。 線虫に感染した魚13匹中3匹の胃の漿膜で同時に卵塊が見つかった。 調査したすべての魚は、幼虫 (内臓) および成体 (胃および腸) のアニサキッドおよびラフィダスカリドにも感染していました。 H. persica sp. の成体 (雄および雌) 11月は観察されなかった。

Huffmanela persica sp.の完全に発達した卵の巨視的および顕微鏡的外観 11月 A H. persica sp.の成体によって以前に産み付けられた卵の肉眼で見える病変。 11月 Muraenesox cinereus の感染組織 (卵巣および胃の漿膜) 内のさまざまなサイズの暗い斑点の形で発生します。 B 感染した卵巣から調製されたウェット マウント。H. persica sp. のさまざまな方向を向いた進行した卵を示しています。 11月卵塊の中に

有病率: 65% (20 人中 13 人が感染)。

語源：種小名の persica (ペルシア語) は、その発生国 (イラン) を指します。

分子的特徴付け: この新種の 18S rDNA (OQ418445)、28S rDNA (OQ428648) および ITS rDNA (OQ428649) のヌクレオチド配列が GenBank に寄託されています。

寄託標本: 宿主 (M. シネレウス) から収集されたシンタイプ卵は、チェコ共和国、チェスケー ブジェヨヴィツェのチェコ科学アカデミー生物学センター寄生虫学研究所蠕虫学コレクションに寄託されました (カタログ番号 N-1277)。

2012 年改訂版国際動物命名規約 [37] の第 8.5 条に定められた規制に準拠するために、新種の詳細が ZooBank に提出されました。 記事のライフ サイエンス識別子 (LSID) は urn:lsid:zoobank.org:pub:84ABB846-5AF2-4008-97F6-573A68DFD1BB です。 新種名 Huffmanela persica の LSID は urn:lsid:zoobank.org:act: urn:lsid:zoobank.org:act:E12D7B01-E298-4BEE-AD69-8C075F84B33E です。

H. persica sp. のはっきりと見える卵 11月ほとんどの場合、感染組織にランダムに分布した、さまざまな寸法の黒い凝集体の形で観察されました（図2B）。 新鮮な卵塊と固定された卵塊からメスでこすり取ったところ、それぞれの卵の発育段階に応じて、着色されていない、茶色または黒色の卵殻を持つ、さまざまな方向を向いた数千個の卵が示されました。 本明細書では、卵の形態学および形態計測、ならびに卵で観察される胚の発育段階に基づいて、卵の発育の 4 つの段階 (未発育の卵から完全に発育した卵まで) を報告します。 これらには、ステージ I (減数分裂期)、ステージ II (有糸分裂初期胚発生期)、ステージ III (胚発生後期)、およびステージ IV (虫状幼虫期) が含まれます。

ステージIの卵（図3A、a、4A〜D、5H）は、おそらく減数分裂Iで最近産まれた卵であり、明らかに球形の核が主に顆粒細胞質の中央に位置し、極には発達していないか、または発達が不十分なプラグが2つあります。 ステージ I の卵は球形 (時々縮んでしわが寄っている) で、明るい琥珀色の硬い卵殻壁を持ち、層状構造は確認できません。 ステージ I で記録された卵子形態計測 (n = 15) は次のとおりでした。全長 (子宮層を含む、UL) 34.14 ～ 44.32 (38.12 ± 2.97)。 全長 (UL を除く) 30.51 ～ 39.51 (34.06 ± 2.76)。 全幅 (UL あり) 32.65 ～ 41.25 (35.50 ± 2.06)。 全幅 (UL なし) 30.45 ～ 37.20 (32.60 ± 1.72)。 シェルの厚さ (UL 付き) 3.27 ～ 6.07 (4.74 ± 0.81)。 シェルの厚さ (UL なし) 1.54 ～ 2.99 (2.47 ± 0.44)。 核の長さ 8.2 ～ 10.71 (9.24 ± 0.87)。 核の幅 7.57 ～ 10.08 (8.53 ± 0.74)。

Huffmanela persica sp.の卵の一般的な形態と表面装飾パターン 11月開発のさまざまな段階で。 A ～ H 発生のさまざまな段階における個々の卵の顕微鏡写真および a ～ h に対応する線画（スケール バー: 20 μm）。 A、非常に初期段階のステージIの卵、おそらく減数分裂Iであり、顆粒細胞質内に球形の核と不完全に発達したキチン質層と極プラグを備えています（ULの表面突起の初期の出現がすでに明らかであることに注意してください）。 B、b 発生後期のステージ II の卵（おそらく減数分裂 II）。 キチンの沈着は完了しているようです。 C、c 初期胚発生の 2 細胞有糸分裂段階 (胚発生)。 D、d 胚発生の後期多細胞段階。 キチン質層は依然として均一に半透明であり、外側キチン質層と内側キチン質層に明らかな分割はありません。 E、e 明視野（光）顕微鏡下で観察すると、豆のような胚とキチン質の層があり、内側の層が暗めの二層になっているように見えるステージIIIの卵。 F、f ULを有するオタマジャクシ様の胚は、キチン質層から部分的に剥がれ落ちているように見える。 G、g 濃い茶色の殻を持つステージ IV の卵。 胚は現在虫状（幼虫化）、3回折り畳まれています（プレッツェル段階）。 H、h 非常に濃い茶色のキチン質層を有する後期ステージ IV の卵。 幼虫は最終発育に近づき、5〜6回折り畳まれます。 I–T あまり発育していない卵（I–L）、中程度に発育した卵（M–P）、完全に発育した卵（Q–T）の顕微鏡写真。最初の画像セット（I、M、Q）は、これらのさまざまに発達した卵の概要を表しています。 、2 番目 (J、N、R)、3 番目 (K、O、S)、および 4 番目 (L、P、T) の一連の画像は、焦点面を調整することで表面の装飾のパターンに焦点を当てています。 黒と黄色の矢印は、それぞれ表面の隆起（発育が進んでいない卵でよく示され、相互接続する隆起、青い矢尻として現れる）の錯覚と卵表面の彫刻を表します。 緑色の矢じりは卵殻表面に不規則な突起を示します。 赤い矢じりは、完全に発達した卵における錯覚的な棘状の外観を示します

Huffmanela persica sp.の不十分に発育した卵 (A ～ D) と完全に発育した卵 (E ～ I) の走査型電子顕微鏡写真。 11月 （感染した卵巣から分離されています）。 あまり発達していない卵は球形（白い矢印は縮んでしわが寄った卵を示しています）で、明らかに発達した極栓がありません。 完全に発達した卵は長方形で、極に2つのプラグを含みます。 卵は、頂点から出現する巻きひげのような虫状の付属物で飾られた均一なベースの乳房状の丘を有するULで完全に囲まれており、場合によっては隣接する丘の付属物に隣接しています（緑色の矢印）。 側面図では、マウンドの底部の重なりによって引き起こされる鋸歯状の尾根（時々、相互接続している錯覚の尾根、黒い矢印の形で）が幻想的に見えることに注意してください（発育の低い卵、赤い矢印でよく観察されます）。 不規則な突起のある卵の殻の外面（黄色の矢印）

ハモの感染組織の組織切片の顕微鏡写真。 A、B Huffmanela persica sp.の卵に感染した胃の組織切片。 11月発生のさまざまな段階と、変性した被嚢後生動物 (⁎) 。 C、D 完全に発育した卵が寄生した胃の漿膜の切片。 E 未熟卵 (➔) と発育中 (➤) の卵の両方のクラスターに感染した卵巣ラメラの切片。組織球と好酸球性顆粒白血球 (⁎) を含む緩い線維肉芽腫性浸潤内に埋め込まれた未熟卵母細胞と卵黄形成前卵母細胞を表します。 F 感染卵巣の組織切片の拡大図。発育のさまざまな段階にある卵のクラスターを取り囲む線維肉芽腫性浸潤を示しています (主に高度に発育した卵、➤)。 G 完全に発達した H. persica の卵の高倍率 (100 倍) の図 (断面図) で、卵殻内に折り畳まれた幼虫と両端に突き出た極栓が示されています。 H ほぼ中央の核 (⁎) と薄い卵殻層を持つあまり発達していない卵と、さまざまな断面で切断された H. persica のねじれた幼虫を含む完全に発達した卵

ステージ II は、単細胞 (おそらく減数分裂 II) 段階から複数細胞の有糸分裂段階までの卵殻内での初期胚発生のさまざまな段階を表します (図 3B、b、C、c、D、d)。 単細胞期の卵（図 3B、b）は、顆粒細胞質内に存在する球形の核と、新しく発達した 2 つの極プラグを有することで区別されました。 2細胞期の卵（図3C、c）は、最初の細胞分裂の結果として対称的なパターンを持っていました。 多細胞段階を含む卵（図3D、d）は胚のさらなる発達を示し、硬い卵殻壁の内部空間は部分的または完全に多細胞塊によって占められていました。 ステージ II の卵は楕円形または長方形で、淡黄色から淡褐色で、極プラグ (明らかに 2 層) がわずかまたは顕著に突き出ており、明確な殻層はありませんでした。 ステージ II で得られた卵の形態計測 (n = 40): 全長 (突き出た極プラグと UL を含む) 46.79 ～ 65.84 (58.26 ± 4.83)。 全長（極性プラグの突出部およびULを除く）43.24～61.85（54.08±4.85）。 全幅 (UL あり) 31.51 ～ 40.80 (35.43 ± 2.23)。 全幅 (UL なし) 30.35 ～ 39.52 (33.57 ± 2.35)。 シェルの厚さ (UL 付き) 3.43 ～ 8.44 (5.20 ± 1.11)。 シェルの厚さ (UL なし) 2.70 ～ 7.57 (4.28 ± 1.14)。 極性プラグ幅 7.52 ～ 15.76 (9.78 ± 1.65)。

胚の高度な発育を示すステージ III の卵（図 3E、e、F、f）は、空間的に分化した形態（豆状またはオタマジャクシ状の胚、図 3E、e、F、f）を持つことによって特徴づけられました。区別できる明らかな殻層と、卵殻内の胚の軽度から中程度の曲がり。 ステージIIIの卵は楕円形または長楕円形で、色は茶色で、2つの突き出た極栓を含み、厚くて暗い外層と並んで薄くて軽い（硝子質）内層を含む二重層の殻を持っています（この層は下の目の錯覚です）キチンの複屈折特性によって引き起こされる光学顕微鏡検査; Bond and Huffman、2023 を参照) [25]。 ステージ III の卵 (n = 27) の形態計測測定は次のように要約されます。全長 (突き出た極プラグと UL を含む) 59.39 ～ 70.98 (62.44 ± 2.60)。 全長（極性プラグおよびULの突出部分を除く）54.75〜61.67（57.39±1.94）。 全幅 (UL あり) 32.46 ～ 44.75 (34.95 ± 3.03)。 全幅 (UL なし) 30.62 ～ 43.30 (32.88 ± 3.05)。 シェルの厚さ (UL 付き) 3.81 ～ 5.73 (4.90 ± 0.52)。 シェルの厚さ (UL なし) 2.92 ～ 5.02 (3.77 ± 0.46)。 極性プラグ幅 8.18 ～ 11.09 (9.39 ± 0.68)。

ステージ IV の卵（図 3G、g、H、h、4E ～ I、5G、I）は、茶色から暗褐色、長方形または楕円形、三倍期（プレッツェル）からの卵内の幼虫形成の程度が異なることによって区別されました。 、図3G、g）から5〜6倍の段階（完全に発達した幼虫、図3H、h）、幅がはるかに厚い暗い外層と2つのはっきりと突き出た極プラグ。 ステージ IV の卵 (n = 71) から得られた形態計測データは次のとおりです。全長 (突き出た極プラグと UL を含む) 60.37 ～ 75.13 (66.62 ± 3.04)。 全長（極性プラグの突出部およびULを除く） 54.37～67.86（62.03±2.94）。 全幅 (UL あり) 32.54 ～ 44.63 (36.46 ± 2.65)。 全幅 (UL なし) 30.96 ～ 43.39 (34.41 ± 2.78)。 シェルの厚さ (UL 付き) 4.48 ～ 7.17 (5.63 ± 0.53)。 シェルの厚さ (UL なし) 3.51 ～ 6.11 (4.63 ± 0.55)。 極性プラグ幅 8.43 ～ 12.00 (10.29 ± 0.79)。 完全に発達した卵の幼虫の幅 6.09 ～ 9.16 (7.91 ± 0.61)。 完全に発達した卵の幼虫の長さ (n = 17) 196.27 ～ 231.49 (209.51 ± 10.64)。

すべての段階の硬い卵殻壁（またはその一体の最外層、Pellicula Ovi）は、表面の不規則な突起で飾られています（図4B〜D、H、I）。 卵は、密集して規則的に配置された乳房状の丘（表面の突起、図3I〜T、4B〜D、F、G）で装飾された薄い透明なULで完全に囲まれており、尖った鋸歯状の隆起を形成しているように見えます（図3J、N、 R) 卵表面上の（相互接続する隆起として時々現れる；図 3J、4D）（隆起の出現は幾何学的錯覚である可能性が最も高い。Žďárská et al. 2001 の図 1 ～ 3、7、8 を参照、図 3J、4D）。 Bond の 30、2020 および Bond and Huffman、2023 の図 24）[25]、光学顕微鏡で検査した卵の表面に微細な表面彫刻が現れました（図 3K、O、S）。 UL 乳房状丘は主に先端から伸びる巻きひげのような虫状の付属物を持ち、隣接する丘の付属物に隣接することもあります (図 4A ～ F)。

感染した魚の胃の漿膜表面には、H. persica sp.の卵が含まれていました。 11月発生のさまざまな段階（図5A〜D）と、変性したカプセル化された後生動物（図5A、B; 雌は通常非常に長く、カプセル化されていることはめったに見られず、カプセル化されているのはめったに見られないため、アニサキスの幼虫型である可能性が高く、ハフマネラの成体型である可能性は低い）卵よりもそれほど厚くはありません）、それらはすべて線維肉芽腫性浸潤物に囲まれていました。 子房の卵性薄板は、線虫 H. persica の発育中の卵の巣に感染しました。 卵は、未熟卵母細胞と卵黄形成前卵母細胞の両方のクラスター内と層板の結合組織内に位置し、組織球と好酸球性顆粒白血球の両方を含む線維肉芽腫性浸潤物によって包まれていました（図5E、F）。

H. persica sp. からの 18S、28S、および ITS 領域の精製 PCR 産物の配列決定 11月結果として、異なる長さの DNA フラグメント (それぞれ 855 bp、1264 bp、および 1127 bp) が得られました。 BLAST分析により、H. persica sp.の18S rDNA遺伝子配列が明らかになった。 11月は、H. を含む淡水硬骨魚から収集されたハフマネラ種と 93 ～ 96% の同一性 (ID) および 83 ～ 96% のクエリ カバレッジ (QC) を共有しました。 Bullard et al.、2022 の huffmani (ON838248、93.12% ID および 96% QC)、H. huffmani (ON838249、94.62% ID および 88% QC)、H. huffmani (ON838251、96.08% ID および 83% QC)、およびH.参照。 huffmani (ON838247、ID 95.80%、QC 83%)、Huffmanela sp.を含む海産軟骨魚から分離されたものでは ID 86 ～ 89%、QC 81 ～ 95% でした。 (ON838247、86.28% ID および 95% QC)、および Huffmanela markgracei Ruiz および Bullard、2013 年 (ON838250、89.38% ID および 81% QC)。 18S rDNA 配列から生成された ML ツリー (図 6) によると、H. persica は以前に報告されたハフマネラの種とは分類されませんでした。 しかし、海洋起源の新種と淡水種のハフマネラ（H. huffmani および H. cf. huffmani）の間に姉妹関係が回復し、これらはすべて硬骨魚に感染することが知られています。 硬骨魚類に感染するハフマネラ種（H. huffmani、H. cf. huffmani、H. persica）と板鰓類に寄生する魚類（H. markgracei および Huffmanela sp.）との間にも姉妹群関係が見出されました。 18S rDNA データセットに基づく系統解析により、Huffmanelinae 亜科の単系統性が強く裏付けられました (図 6)。

新種 Huffmanela persica sp. の 18S rDNA データセットを使用して再構築された最尤 (ML) 系統図。 11月およびTrichosomoididae、Trichinellidae、TrichuridaeおよびCapillariidae科内の他の関連種。 ML 分析は、1000 回のブートストラップ複製による置換モデル K2 + G を使用して実行されました。

ハフマネラの発生中の卵の説明と検査は、この属の分類学と生物多様性に関する貴重な情報を提供します [38、39]。 しかし、卵に基づくハフマネラ属のさまざまな種の鑑別比較は、主に宿主と寄生虫の相互作用を考慮した完全に発達した卵の寄生虫学的分析に従って実行されることが示唆されている[15、39]。 したがって、診断特性の組み合わせは、ハフマネラ種の識別に以前に適用されてきました。 これらには、形態計測分析 (卵の測定)、一般的な形態 (色、形状、構造、表面装飾)、宿主の種、宿主の体内の好ましい感染部位 (寄生虫が感染する特定の組織)、および地理的場所が含まれます。 ハフマネラ・ペルシカ sp. 11月ハフマネラの他の認められている名前のない種とは主に、異なるサイズの卵、明確なULの装飾、めったに観察されない卵殻の装飾などのさまざまな特徴を持つことで区別できます。 新種の進化した卵の寸法（長さと幅の両方を考慮すると）（54～68 × 31～43 μm）は、H. huffmani の寸法（54～60 × 30～33 μm）と酷似または部分的に似ています[1]。 .参照。 huffmani (54–66 × 27–33 µm) [5]、H. markgrasei plectropomi Justine、2011 (64–76 × 29–35 µm) [40]、H. hamo Justine および Iwake、2014 (65–78 × 33) –38 µm) [12]、Huffmanela moraveci Carballo および Navone、2007 (50–57 × 23–31 µm) [41]、H.longa Justine、2007 (58–72 × 22–34 µm) [2]、H . balista Justine、2007 (63–78 × 32–41 µm) [2]、H. mexicana Moravec および Fajer-Avila、2000 (63–66 × 30–33 µm) [22]、H. selachii Al-Sabi et al.、2022 (63–90 × 30–56 µm) [42] および Huffmanela sp. Attia et al.、2021b (62–75 × 30–36 µm) [43]。 一方、H. persica sp.で観察されたように、 11月隆起と乳房状の丘の形で、卵殻またはULに関連する独特の形状の装飾は、Huffmanela schouteni Moravec and Campbell、1991年（隆起のあるUL）[44]、H. banningi Van Banning、1980年（ULは棘状と思われる）について以前に記載されている。 [20]、H. huffmani [1]、H. japonica Moravec et al.、1998 (突起のある卵の殻) [18]、H. canadensis Moravec et al.、2005 (横方向の隆起のある卵の殻) [45]、H. lata Justine、2005 (卵殻は棘状と思われる) [39]、H. balista (卵殻は縦方向の隆起がある) [2]、H. moraveci (卵殻は棘状) [41]、H. markgrasei (卵殻は横方向の隆起がある) [46]、 H. oleumimica Ruiz et al.、2013 (卵殻棘状) [15]、Huffmanela sp. (突起のある卵の殻) [43]、H. cf. huffmani (棘のある UL) [5] および H. psittacus Carvalho et al., 2022 (縦方向、斜め方向、および横方向の隆起のある殻) [6]。 上述の種のうち、Ｈ．ｐｅｒｓｉｃａ ｓｐ． 11月卵の大きさが異なることにより、H. schouteni、H. banningi、H. oleumimica、H. markgracei、H. lata、および H. psittacus と容易に区別できます (表 3)。 同様に、H. persica sp. の卵も同様です。 11月 H. japonica や H. moraveci に比べて幅が広い。 新種の卵は、Huffmanela plectropomi、H. hamo、H.longa、H. mexicana、H. japonica、H. canadensis、H. moraveci、H. ballista、H. selachii、および Huffmanela sp の卵とは著しく異なります。 [43] 独特の表面構造（H. persica sp. nov.では突起のある卵殻と、巻きひげのような虫状の付属物で飾られた乳房状の丘を備えたULと、H. hamo、H. longa、H. mexicana、H. の滑らかな卵殻）を持つことによる。 . セラキイ; H. canadensis では横方向の隆起のある卵殻; H. balista では縦方向の隆起のある卵殻; H. plectropomi、H. hamo、H. canadensis および H. selachii では UL の欠如; H. japonica、H. では滑らかな UL Attia et al.、2021b) の moraveci、H. balista、および Huffmanela sp.。 H. huffmani および H. cf. の卵の測定値。 huffmani [5] は新種のそれらとよく似ています。 それにもかかわらず、淡水起源のこれらの種は、海洋種の H. persica sp. から分離することができます。 11月隆起のない卵殻（対隆起のある卵殻）や、乳頭状の棘を持つ明確な卵UL（対乳状丘のあるUL）などの特徴に応じて異なります。 ハフマネラ・ハフマニとH. cf. ハフマニは、それぞれ米国のセントラルキダ科とポエチリ科の淡水魚から記載されました[3、5]。

Muraenesox cinereus は、ペルシャ湾を含む西インド太平洋領域に広く分布する海洋性の魚種です [47,48,49]。 ペルシャ湾地域から採取された海産硬骨魚類および板鰓魚類の、名目上 (H. selachii) [42] および無名のハフマネラ種 (Huffmanela sp. of Attia et al., 2021a、Huffmanela sp. of Attia et al., 2021a) による感染に関する以前の報告が入手可能である。 Attia et al., 2021b、および Al-Hasson et al., 2019 の Huffmanela sp. [43, 50, 51]。 しかしながら、Ｈ．ｐｅｒｓｉｃａ ｓｐ． 11月は、卵の大きさ、卵の重なり、感染組織、宿主魚に基づいてこれらの種と区別できます（表 3）。 Justine and Iwake (2014) は、ウナギ目魚 M. cinereus (日本沖) の体細胞組織から採取した H. hamo の卵について記載しましたが、これは前述したように新種とは形態学的に異なります [12]。 しかし、この研究では、H. persica sp.の卵が使用されました。 11月同種の卵巣と胃の漿膜で検出されたことは、ハフマネラの異なる個体群に寄生した組織がこの属に特有の種であることを示唆している[11、45]。 ハモの幼虫と成虫の生態はほとんど知られていません。 天然水に生息するアンギリ科レプトケファリスの腸からは、これまでに食物物質が検出されたことはありません。 Hulet (1978) が結論付けているように、ウナギ状レプトセファリの腸はほとんど分化しておらず、突き出た歯によって穿刺された生物からの原形質液は幼虫段階で食道および胃の上皮を通って吸収される可能性がある[52]。 以前の研究では、飼育飼育されたハモの幼生がクロレラ、ワムシ、原生動物、ウニの受精卵、植物プランクトンなどの食物を攻撃することは確認されていない[53]。 しかし、より大きなサイズのハモは、魚、甲殻類、頭足類を含む深層外洋、底生および小さな底生生物を食べる活発な捕食者です[54、55、56]。 西アフリカのポルトノボで採取されたハモの胃の内容物は、主にサバ、ハモ類、カランクス種、イカ、トビウオで構成されていることが判明した[57]。 別の研究では、Engraulis japonicus (Engraulidae) が韓国の固城沖の沿岸海域で採取されたハモの主な好まれる獲物であることも明らかになった [58]。 残念ながら、ペルシャ湾におけるハモとその好まれる獲物の生息地の利用、摂食習慣、季節の食性嗜好に関する研究は不足しているため、中間宿主またはパラテン性宿主がハモの生活環に関与しているかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。 H. persica sp. 11月

H. persica sp. の卵塊 11月感染した魚の卵巣と胃の漿膜で観察されました。 同様に、漿膜のある組織は、H. schouteni (腸漿膜) [44]、H.longa (腸間膜) [2]、H. plectropomi (浮き袋付近の腸間膜) [40]、H. cf. の卵で感染させた。 ハフマニ (内臓腹膜) [5] およびハフマネラ sp. （腸間膜） [51]。 Ｈ．の卵による感染。参照。 ハフマニは、カモノハシ (Xiphophorus variatus) の生殖腺 (精巣) でも検出されました [5]。 この研究では、H. persica の卵が類上皮細胞と好酸性顆粒球に囲まれていることが判明し、寄生虫の感染によって生じる炎症反応が示唆されています。 異なる種のハフマネラの卵または線虫による細胞間および細胞内感染によって誘発される免疫病理学的反応は、さまざまな魚宿主で以前に報告されており、感染組織に対する寄生虫によって引き起こされる物理的および化学的損傷を反映しています。 これらには、肉芽腫性炎症（主に単核食細胞の浸潤を特徴とする）、細胞間浮腫（海綿状症）、細胞適応反応（肥大性、萎縮性、過形成性変化）、変性および壊死性変化、変性および異栄養性石灰化が含まれます [5、6、10、 16、43、59、60、61、62、63]。

旋毛虫上科は現在、Capillariidae、Trichinellidae、Trichuridae、Cystoopsidae、および Trichosomoididae を含む 5 つの科で構成されています [33, 38]。 Moravec (2001) によると、トリコソモイダ科には 3 つの亜科、Anatrichosomatinae Smith and Chitwood, 1954、Huffmanelinae Moravec, 1987、および Trichosomoidinae Hall, 1916 が含まれます [38]。 アナトリコソソマティナエとハフマネリナエには、アナトリコソーマ (Smith and Chitwood, 1954) とハフマネラという 1 つの属しか含まれていませんが、トリコソモイディナエには、トリコソモイデス属 (Railliet, 1895) とトリクロイデス属 (Ricci, 1949) の 2 つの属が含まれています。 Hodda (2022) は最近、Trichosomoididae 科の Paratrichosoma 属をリストに記載しました (Ashford and Muller, 1978)。 ただし、この属は以前に Capillaria の同義語であることが示唆され、Capillariidae 科に分類されました [24、38、64、65]。 この研究では、18S rDNA 配列に基づく系統解析により、ハフマネラと旋毛虫の間の姉妹関係が回復されました (Railliet、1895)。 これら 2 つの属間の姉妹群関係は、以前の研究 [5] のベイズ系統解析によっても裏付けられました。 ハフマネラ属の種間の系統関係は、最大の支持を得て 2 つの異なる分岐群を明らかにしました。 最初のクレードである軟骨魚類 (板鰓) 関連クレードには、海洋板鰓類の魚から収集されたハフマネラ種 (H. markgracei および Huffmanela sp.) が含まれます。一方、2 番目のクレードである硬骨魚類 (硬骨魚) 関連クレードは、海洋 (H. . persica）および淡水魚（H. huffmani および H. cf. huffmani）の硬骨魚。 しかし、淡水種のハフマネラが海洋祖先に由来するかどうかを解明するには、硬骨魚類に感染する海洋種のハフマネラの核およびミトコンドリアrRNA遺伝子を表すさらなるヌクレオチド配列が必要である[66]。 ハフマネラの淡水種が海洋分類群のグループ内に入れ子になっている単系統グループを示している場合、ハフマネラ属は海洋起源を持つ可能性があるという仮説を裏付ける可能性があります [5、67、68]。

我々の知る限り、本研究はハフマネラ属に属する種の核rDNAの28SおよびITS領域の分子配列を初めて提供するものである。 ハフマネラの海洋種の系統学的位置は、新種から得られた 18S rDNA 配列データと淡水種のハフマネラから以前に記載されているデータの分析に基づいて初めて証明されました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 この新種の 18S rDNA (OQ418445)、28S rDNA (OQ428648) および ITS rDNA (OQ428649) のヌクレオチド配列が GenBank に寄託されています。

小サブユニットリボソーム DNA

大サブユニットリボソーム DNA

身元

内部転写スペーサー

ヘキサメチルジシラザン

ライフサイエンス識別子

最尤度

ポリメラーゼ連鎖反応

クエリカバレッジ

リボソームDNA

子宮層

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走査型電子顕微鏡検査は、オーストリアのウィーン バイオセンター (VBC) のメンバーであるウィーン バイオセンター コア施設 (VBCF) の電子顕微鏡検査施設によって実行されました。 著者らは、オーストリア、ウィーンの Vienna BioCenter Core Facilities の Thomas Heuser 氏と Nicole Drexler 氏の優れた技術サポートに感謝します。 著者らは、この論文のさまざまなバージョンについて洞察力に富んだ提案と有益なコメントをくださった František Moravec 教授 (チェコ科学アカデミー生物学センター、寄生虫学研究所、Branišovská 31, 37005 České Budějovice, Czech Republic) と匿名の査読者 2 名に心から感謝します。 。 筆頭著者は、イランのアフヴァーズのシャヒード・チャムラン大学獣医学部臨床科学科で行われた予備調査において貴重なご協力をいただいたラヒム・ペイガン教授とザーラ・トゥラビー・デズフリー博士に感謝します。 著者らは、この研究に多大な貢献をしていただいた Amin Mirzazadeh 博士 (ベーリンガーインゲルハイム、RCV GmbH および Co KG、オーストリア、ウィーン) に感謝の意を表します。

この論文のオープンアクセス資金はウィーン獣医大学 (Vetmeduni Vienna) から提供されました。 この研究は、オーストリアのウィーンにある獣医大学から資金提供を受けました。

獣医大学魚類健康部門、1210、ウィーン、オーストリア

レザ・ガネイ＝モトラグ、ゴクレシュ・クマール、マンスール・エル＝マトブーリ、モナ・サレハ

プリンスエドワードアイランド大学、アトランティック獣医大学、病理学および微生物学部、シャーロットタウン、PEI、カナダ

レザ・ガネイ＝モトラ & マーク・D・ファスト

水生診断サービス、アトランティック獣医大学、プリンスエドワードアイランド大学、シャーロットタウン、PEI、カナダ

デビッド・グローマン

アシュート大学獣医学部水生動物医学科、アシュート大学、71515、エジプト

ハテム・ソリマン

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ME と RG が研究を設計しました。 RG はサンプルを収集し、実験を実行し、原稿を作成しました。 HS、MS、GK は分子実験に参加しました。 DGとGKは病理検査に貢献した。 ME、MF、MS がこの研究を調査しました。 ME、MF、MS、HS が批判的なコメントを提供し、原稿の最終版を編集しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Reza Ghanei-Motlagh または Mona Saleh への通信。

適用できない。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Ghanei-Motlagh, R.、Fast, MD、Groman, D. 他 Huffmanela persica sp.の説明、分子同定および病理学的病変 11月 (線虫目: Trichosomoididae: Huffmanelinae) ダガートゥース パイク アナゴ Muraenesox cinereus から。 寄生虫ベクター 16、182 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13071-023-05772-7

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受信日: 2023 年 2 月 21 日

受理日: 2023 年 4 月 9 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05772-7

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