シングル

Dec 19, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 885 (2023) この記事を引用

2633 アクセス

131 オルトメトリック

メトリクスの詳細

刺胞細胞は、刺胞動物（サンゴ、クラゲなど）に特有の爆発性の刺細胞です。 獲物の捕獲と防御に特化した刺胞細胞は、形態学的にも機能的にも異なる 30 を超える細胞タイプのグループで構成されています。 これらの珍しい細胞は、生物学的新規性の象徴的な例ですが、刺傷装置の多様性を推進する発生メカニズムはあまり特徴付けられていないため、刺細胞の進化の歴史を理解することが困難になっています。 私たちは、イソギンチャク Nematostella vectensis で CRISPR/Cas9 を介したゲノム編集を使用して、単一の転写因子 (NvSox2) が 2 つの選択的な刺細胞の運命の間のバイナリー スイッチとして機能することを示します。 NvSox2 のノックアウトにより、貫通細胞が罠細胞に変化します。これは他の種のイソギンチャクでは一般的ですが、N. vectensis では抑制されているようです。 これらの結果は、単細胞隔世遺伝の珍しいケースを明らかにし、細胞型のアイデンティティの多様化についての理解を広げます。

新しい細胞型は、新しい生理学的機能の起源を促進し、生物多様性の拡大に不可欠です。 しかし、新しい細胞型の起源を駆動するメカニズムを理解することは、生物学における永続的な課題です1,2。 多細胞生物における形質進化の研究により、「ホメオシス」（生物の一部が別の部分に変化すること）が形態学的革新の重要な源であることが特定されています3。 このようなホメオティックな新規性の一般的な例には、顕花植物の花弁からがく片への変換や、昆虫の腹部から胸部への変換が含まれます。 その後、これらの形質転換は、局所的に発現する調節遺伝子によって制御されることが示されており 5,6 、複雑な表現型の発達が単一の遺伝子スイッチによってどのように調整され得るかを実証しています。 より最近では、ホメオシスが単一細胞レベルでどのように変化が起こるかを説明するために援用されています。 線虫、ハエ、脊椎動物の神経分化の研究では、ある神経サブタイプを別のサブタイプに変換するのに十分な個々の調節遺伝子が同定されており、ホメオシスが細胞運命の個性を制御している可能性があるという考えが裏付けられています7。 しかし、これまでのところ、個々の細胞型のレベルで隔世遺伝（祖先形質の再出現）のホメオティックな誘導を実証した研究は存在しない。 このような実証は、ホメオシスがどのようにして細胞型の多様化を促進し、動物の複雑さの拡大を促進するのかについての機構的な理解を提供するだろう。

刺細胞 (刺胞細胞) は、すべての細胞タイプの中で形態学的に最も複雑な細胞の 1 つであり、細胞の新規性の象徴的な例です (図 1)。 刺胞動物（サンゴ、クラゲ、およびその近縁種を含むクレード）のみに見られる刺細胞は、獲物の捕獲、防御、生息地の利用に特化した多様な細胞で構成されており、分類群全体で形態と機能の両方が大きく異なります8。 実際、刺胞動物の各種に見られる一連の刺胞型は、現存する刺胞動物の 13,000 種の 2/3 以上を構成する軟体分類群の診断的特徴として最も有益であることは間違いありません 9,10。 現在、刺細胞の 3 つの主要なサブタイプが認識されており、それらの刺細胞小器官の形態によって区別できます 11。 1つ目は、線虫細胞（「貫通細胞」）（図1a〜c、g、h）で、反転可能な毒を含んだ細管を含む厚いカプセル壁を持つ爆発性の細胞小器官を持っています12、13、14、15。 刺胞動物全体で、30 を超える異なる種類の線虫細胞が記載されていますが、それらは尿細管の基底のとげのある部分 (以下「銛」と呼びます) の形態が大きく異なります 8。 2 番目の刺細胞タイプであるスピロサイト (「罠細胞」) は、形態学的変化がはるかに少なく、全体的な外観がしなやか (薄い) または頑丈 (厚い) のいずれかであると説明されています 16。 これらの細胞はまだ突き出ているが、穿刺細胞には見られない 2 つの特徴によって代表される。1 つは鋸歯状の外観を持つ薄いカプセル壁で、これはカプセル内壁を裏打ちする規則的に間隔をあけた繊維のネットワークに由来し、もう 1 つは細い側方ロッドで飾られた可逆細管である。放出時に罠の巣を作成します17（図1d–f、i）。 刺細胞の3番目のグループである付着細胞（付着細胞）は、毒素を含んでいることは知られておらず、そのペイロードは、薄壁のカプセルの内側に折り畳まれたひだ状の粘着性の細管のみで構成されています18（図1j–l）。 門全体に貫通細胞（刺胞細胞）が広く分布していることは、この細胞タイプが刺胞動物の最後の共通祖先に存在していたことを示唆しています（図1m）。 捕捉細胞型と付着細胞型 (それぞれスピロサイトと翼状細胞) の分布がより限定されているということは、これらの細胞型が貫通性の祖先から進化したことを意味します。 しかし、刺傷装置の形態の変動を制御する発生メカニズムは特徴付けられていません。 したがって、これらの珍しい細胞型の多様化を促進する進化的要因は未解決のままです。

a、b イソギンチャク Nematostella vectensis の腸間膜から放出された線虫細胞 (SEM)。頂端の皮弁 (b - 緑色、疑似色) と反転した銛 (白い矢印) に沿った棘が示されています。 c 頂端皮弁（緑色）と厚いカプセル壁（矢印）を示すN. vectensisの腸間膜からの未排出線状細胞（TEM）の頂端。 d イソギンチャク Calliactis tricolor の触手から放出されたスピロサイト (SEM)。頂端皮弁の欠如と、裏返した尿細管上の棘がないことが示されています (白い矢印)。 e、f N. vectensis の触手からの未排出スピロサイト (TEM)。頂端のキャップ (オレンジ色、疑似色) と薄い鋸歯状のカプセル壁 (白い矢印) を示します。 スピロサイトのカプセル壁の鋸歯状の外観は、規則的に配置された繊維の内部ネットワークから生じます (f の白い矢印)。 細い側方桿体が尿細管を飾り、断面では小さく暗い点として見えます (e の黒い矢印)。 g、h 厚いカプセル壁を示す N. vectensis の壊れた刺胞嚢の SEM (黒い矢印)。 i N. vectensis からの無傷のスピロサイトカプセル。 細管のコイルは薄いカプセル壁を通して見ることができます (2 つのコイルは破線で区切られています)。 j チューブイソギンチャク Ceriantheopsis americana の体壁から排出された鱗球 (SEM)。 反転した尿細管には棘がありませんが、縦方向のひだがあります (白い矢印)。 k C. アメリカーナの体壁からの未排出の扁球細胞の頂端は特殊化を示さない（紫色、偽色）。 l C. アメリカーナからの未排出の扁球細胞の被膜内のひだ付き細管の断面図。 カプセルの壁は薄く、鋸歯状ではありません (白い矢印)。 m Kayal et al.10 による刺胞動物の系統図。 右側のボックスは、各種類の刺細胞の存在 (灰色) または非存在 (白色) を示します。 3 種類の刺傷細胞の推定された起源がツリー上にプロットされています。 点描の灰色は粘液虫の高度に派生した刺細胞を反映しています。 N 線状細胞、S スピロサイト、P 翼状細胞。 *非ケリアンティッドヘキササンゴ。 このクレードには現在受け入れられる名前がありません。 +粘液虫とポリポディウム。

Sox 遺伝子は、動物全体の細胞運命の決定において指導的な役割を果たす転写因子のファミリーです 19。 さまざまな Sox オルソログの組織限定発現は刺胞動物で以前に実証されており、これは異なる細胞型のパターン化におけるこれらの転写因子の役割と一致しています 20、21、22、23、24。 今回我々は、単一の Sox 遺伝子 NvSox2 が、刺し細胞の 2 つの運命 (刺突と罠) の間のホメオティックスイッチを制御していることを示す。 イソギンチャクの系統発生の文脈で解釈すると、これらの結果は、刺胞動物全体に異なる種類の刺細胞が不連続に分布していることの説明を提供し、単細胞隔世遺伝が新規性の進化を推進する重要なメカニズムである可能性があることを示唆しています。

N. vectensis では、刺細胞は外胚葉上皮全体に見られますが、動物の各領域には刺細胞タイプの異なる組み合わせが存在します 25。 たとえば、触手の先端には大小の基底性イソリザ線状細胞（貫通細胞）と軟性スピロサイト（捕捉細胞）が生息しているのに対し、体壁（外上皮）には大小の貫通細胞のみが生息しています（図2a、b）。 ）。 腸間膜（消化組織）の外胚葉上皮には主に微塩基性マスティゴフォア（別のタイプの穿刺細胞）が生息しており、足にはほぼ独占的に小さな基底性イソリザが生息しています（図2c、d）。 さまざまな種類の刺細胞の分布と相対的な存在量を図 2b にまとめます。

143uM DAPI で標識された一次ポリープ。核と成熟した刺細胞の被膜が示されています (N = 10 ポリープ)。 小さい（青）と大きい（黄色）のバシトリッヒが示されています。 挿入図: 軟性スピロサイト (マゼンタ) と大型の基底細胞 (黄色) が触手に豊富に存在します。 b N. vectensis における刺細胞タイプの分布。 図は以下から変更されました: Babonis, LS, Ryan, JF, Enjolras, C. & Martindale, MQ トリプトームのゲノム解析により、腺細胞進化の分子機構が明らかになりました。 EvoDevo 10、23 (2019) - CC BY 4.0。 c 腸間膜には主にマスチゴフォア (緑色) が存在します (N = 12 ポリープ)。 d 小さなバシリッチが体壁と足を支配しています（143uM DAPI）（N = 10ポリープ）。 e NvSox2 と PaxA の発現は重複しています (N = 8 胚)。 白矢印: 両方を発現する細胞、黒矢印: PaxA のみ、点線の円: NvSox2 のみ。 f NvSox2 は、SoxB2 ノックダウンに応答して有意に下方制御されますが (ddCT 法、p = 1.12E-2)、PaxA のノックダウンには有意な影響を受けません (ddCT、p = 0.345957) (qPCR)。 エラーバーは + /- 標準偏差を示します。 各処理についての 3 つの反復実験が示されています (黒い点)。 灰色のバーは 3 回の実験の平均を示します。 g 作業モデル。 h NvSox2 発現は、NvSox2 変異体では廃止されています。 i 野生型および変異体（白いボックスおよび挿入図）の触手（白い矢印および挿入図）および体壁（黒い矢印および挿入図）におけるPaxA発現。 j 体壁で PaxA を発現する細胞の定量分析 (Mann-Whitney U、p = 1.37E-11)。 N = 32 (野生型) および N = 30 (変異型) の動物を治療ごとに検査しました (一次ポリープ段階)。 k Mcol1 mRNA (マゼンタ) は、野生型の触手 (白い矢印) および体壁 (白いボックスと挿入図) で Mcol4 タンパク質 (α-Mcol4、シアン) と共発現します。 NvSox2 変異体の体壁では Mcol1 発現が減少しています。 核 - 白色、DAPI。 l Mcol1とMcol4を共発現する体壁細胞の定量分析（Mann-Whitney U、p = 1.57E-4）。 N = 1 処理あたり 10 匹の動物 (触手芽段階)。 a、e、i、k では口腔極が左側にあります。 すべてのボックス プロット: 中央値 - 中央線、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル - ボックス、5 パーセンタイルと 95 パーセンタイル - ひげ、外れ値 - 個々の点。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 蛍光画像はフィジーを使用してコントラストと明るさを調整しました。

NvSox2 は、N. vectensis の 14 個の Sox 遺伝子のうちの 1 つであり、そのうちの 2 個 (SoxB2 と NvSox2) だけが外胚葉全体の個々の細胞で発現されており、このパターンは初期胚発生時の末端細胞の同一性の仕様と一致しています 20。 NvSox2の発現をさらに調べたところ、発生中の刺細胞において転写因子PaxAと共発現していることがわかりました（図2e）。 NvSox2のみを発現する細胞、NvSox2とPaxAの両方を共発現する細胞、PaxAのみを発現する細胞を同定したことから、NvSox2、次にPaxAの連続活性化が示唆された。 qPCRをモルフォリノ媒介遺伝子ノックダウンと組み合わせて使用​​すると、SoxB2（ニューロンおよび刺細胞の前駆細胞で発現）22のノックダウン後のNvSox2発現の有意な抑制が見出され、PaxAのノックダウンに応答したNvSox2発現に有意な変化は見られませんでした（図2f） ）。 まとめると、これらの結果は、初期分化中の刺細胞においてNvSox2がSoxB2の下流でPaxAの上流にあることを示唆しています（図2g）。 刺細胞の指定におけるNvSox2の機能を理解するために、CRISPR / Cas9媒介ゲノム編集を使用して、NvSox2遺伝子座のF2ホモ接合性ノックアウトを生成しました（補足図1）。 NvSox2 は胞胚段階で最初に発現され、外胚葉全体に散在する個々の細胞で発生初期を通じて発現され続けます。 この発現は、NvSox2変異体では完全に廃止されています（図2h、補足図2）。 我々は、これらの NvSox2 変異体をポリープ段階まで成長させ、NvSox2 の喪失による分子的および形態学的影響を調査しました。

刺細胞の運命における NvSox2 の分子的役割を理解するために、野生型および NvSox2 ノックアウト (変異体) 動物で刺細胞に特異的であることが知られている遺伝子の発現を調べました 25,26。 転写因子PaxA（図2i、j;補足図3）および構造分子ミニコラーゲン-1（Mcol1;図2k、l）（両方とも細胞特異的）の発現は、NvSox2の体壁で大幅に減少しました。突然変異体。 対照的に、あらゆる種類の刺細胞に見られるミニコラーゲン 4 (Mcol4) は影響を受けませんでした。 刺細胞発生の定量分析により、野生型ポリープの体壁にあるMcol4標識細胞の80％もMcol1を発現しており、NvSox2変異体ではこの割合が10％未満に大幅に減少していることが明らかになりました（図2l）。 これらの結果は、NvSox2 のノックアウトが体壁に特定された刺細胞の総数に影響を及ぼさなかったが、この組織内の刺細胞のアイデンティティを変換したことを裏付けています。

N. vectensis では、野生型ポリープの体壁には、単一タイプの穿孔細胞である小さな基底性イソリザがほぼ独占的に存在しています (図 3a)27,28。 体壁刺細胞の発達に対するNvSox2ノックアウトの影響をさらに調べるために、光学顕微鏡および電子顕微鏡を使用してこれらの細胞の形態を調べました。 NvSox2変異体では、体壁の小さな貫通細胞が形態学的に異なる細胞型に完全に置き換えられました（図3b）。 全体的なレベルでは、この変異細胞タイプは、N. vectensis には通常見られないが、他のイソギンチャクにはよく見られる刺細胞の一種である丈夫なスピロサイト (罠細胞) の外観を持っていました (出典データ)。 我々は、走査電子顕微鏡法および透過型電子顕微鏡法（それぞれSEMおよびTEM）を使用して、これらの変異細胞を調査し、細胞の特徴を捕らえている証拠を調べた。 野生型ポリープの体壁からの刺細胞は、厚いカプセル壁と頂端（外側を向いた）端に顕著なフラップを備えた硬いカプセルを持っていました（図3c〜e）。 排出されると、これらの刺細胞は、近位に大きな棘（「銛」）と遠位に小さな棘を備えた突出尿細管を明らかにしました（図3f）。 これらの特徴は、イソギンチャクの貫通細胞の診断に役立ちます25、29、30。 対照的に、押し出された変異体細胞のカプセルは薄っぺらで、排出時に崩壊するように見え、押し出された装置は棘と棘のない滑らかな細管で構成されていました（図3g）。 変異細胞はまた、内面に沿って鋸歯状の外観を持つ薄いカプセル壁と平らな頂端キャップを持ち（図3h–j）、これは細胞を突き刺すのではなく、細胞を捕らえるのと一致する特徴です17、31、32。 さらに、変異細胞内の内部移行した突出細管の断面からは、放出されていない捕捉細胞の外観と一致する小さなロッドが明らかになりました（図3k）。ただし、これらのロッドは、で見つかった捕捉細胞について説明されているものよりも小さく、数も少なかったです。野生型動物17． 細胞系統標識がなければ、NvSox2 のノックアウトが N. vectensis の体壁の 2 つの異なる細胞系統において貫通細胞の喪失と捕捉細胞の増加の両方を引き起こした可能性を排除することはできません。 NvSox2 の喪失が体壁の Mcol4 を発現する刺細胞の数に影響を及ぼさなかったことを考慮すると、これらの結果の最も簡単な説明は、NvSox2 の喪失により、N. vectensis の体壁において小さな穿刺細胞が罠細胞に変化するということです。

a NvSox2、PaxA、および Mcol1 は、体壁の小さな穿孔細胞 (青色) の発達に必要です。 図は以下から変更されました: Babonis, LS, Ryan, JF, Enjolras, C. & Martindale, MQ トリプトームのゲノム解析により、腺細胞進化の分子機構が明らかになりました。 EvoDevo 10、23 (2019) - CC BY 4.0。 b 青い矢印: 小さな貫通セル。 白い矢印: 変異細胞。 M: 中膠、Ecto: 外胚葉。 セルが偽色になります。 画像は、a の青いボックス内の領域に対応します。 N = 1 回の治療につき 2 個の若年性ポリープ。 c – k 野生型c – fおよび変異型g – kの幼若ポリープの体壁からの刺細胞の電子顕微鏡写真（治療あたりN = 2個体）。 c–e 小さな穿孔セルの TEM。 c のボックスは、d と e で強調表示された領域を示します。 dでは、頂端皮弁が偽色で表示されています。 e の黒い矢印は、厚いカプセル壁を強調表示します。 f 小さなピアスセルの SEM。 関連する構造は疑似色で表示されます。黄色 - カプセル、緑 - 頂端皮弁、マゼンタ - 棘のある銛、青 - 返しのある細管。 f の挿入図は細管の詳細を示しています。 g 棘と棘を欠いた変異体刺細胞の SEM。 変異刺細胞の h–k TEM。 h ボックスは、i ～ k で強調表示された領域を示します。 高倍率画像は、i 頂端キャップ (偽色のオレンジ色)、j 薄い鋸歯状のカプセル壁 (後ろ矢印)、および k 短い側方ロッドを備えた内在化した尿細管 (白い矢印) を示しています。 l 軟性（灰色）およびロバスト（黒色）捕捉細胞（文献から抽出）および変異細胞（オレンジ）における莢膜形態計測（幅 vs 長さ）（ANCOVA、軟性対ロバスト：p = 0.42032、軟性対変異体：p = 0.30121） ）。 N = 分析された細胞の数。 m 弱性細胞、変異体、および強固な捕捉細胞における莢膜幅 (Bonferroni 事後分散分析、弱性 vs 変異体 p = 5.2E-06; ロバスト vs 変異体 p = 1.3E-11; 弱性 vs ロバスト p = 2E-16)。 平均はパネル l に示されているのと同じデータから計算されます。 n 野生型および変異ポリープにおける変異表現型を持つ細胞の豊富さ（Mann-Whitney U、p = 3.2E-5）。 N = 1 回の治療あたり 12 個の原発ポリープ。 すべてのボックス プロット: 中央値 - 中央線、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル - ボックス、5 パーセンタイルと 95 パーセンタイル - ひげ、外れ値 - 個々の点。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

成熟した捕獲細胞の標準的な形態学的特徴を備えているにもかかわらず、NvSox2 変異体の体壁で発達した細胞は、野生型動物の触手の先端で発達する軟性捕獲細胞とは形態学的に異なっており、NvSox2 の喪失が原因であるという仮説を立てました。 N. vectensis の体壁における強力な捕捉細胞の発達。 「ロバスト」および「グラシル」条件は明確に定義されていません。 これを解決するために、我々は、頑丈であるか、またはしなやかであると報告されている文献から、放出されていない捕捉細胞からカプセルの長さと幅を分析しました。 カプセルの幅と長さの関係は、さまざまなサイズの強固な捕捉細胞と繊細な捕捉細胞で違いはありませんでした（図3l）。 ただし、所定の長さでは、堅牢な捕捉細胞は軟性細胞よりも大幅に幅が広かった（図3l、m）。 NvSox2変異体の体壁で発達したカプセルの幅は、文献で軟弱な捕捉細胞と堅牢な捕捉細胞について報告されているカプセルの幅とは異なり、その中間です（図3m）。 驚くべきことに、野生型動物の検査により、非常に低い頻度ではあるものの、この変異形態を持つ細胞の存在が明らかになりました。 NvSox2変異体では変異細胞タイプが刺細胞のほぼ50%を構成していましたが、野生型の刺細胞のこの形態を持っていたのは1%未満でした（図3n）。 調べた12個の野生型ポリープのうち、これらの変異細胞が完全に欠けているように見えるのは1個だけであった。 これらの結果は、NvSox2 調節経路でエラーが低頻度で自発的に発生し、その結果、野生型動物で強力な罠細胞が発生する可能性があることを示唆しています。 堅牢な罠細胞は他のイソギンチャクにもよく見られ、豊富に存在するため (出典データ)、この細胞タイプがすべてのイソギンチャクの最も最近の共通祖先に存在した可能性が高いと示唆するのは合理的です。 したがって、我々の結果は、NvSox2 のノックアウトが N. vectensis の単細胞隔世遺伝、つまり祖先細胞型 (堅牢な罠細胞) の回復をもたらしたことを示唆しています。

捕捉細胞の正体をさらに調査するために、N. vectensis における天然の軟性捕捉細胞と変異捕捉細胞の分布と発生を調べました。 野生型動物とNvSox2変異体動物の両方で、軟性スピロサイトは触手の先端でのみ見つかりました（図4a）。 対照的に、小さな貫通細胞は野生型動物の触手にのみ存在し、変異型捕捉細胞はNvSox2変異体動物の触手にのみ存在した。 これらの結果は、体壁で見られる小さな穿孔細胞の変異細胞への変換と一致しており（図3）、小さな穿孔細胞が主な細胞タイプです。 軟性捕捉細胞と変異捕捉細胞が分子的に異なるかどうかを調べるために、カルメニン F (CaluF)33 と呼ばれる Ca2+ 結合タンパク質の発現を調べました。 野生型動物では、CaluFは、薄細胞の分布と一致して触手でのみ発現され、抗Mcol4抗体で標識された細胞で共発現され25、刺細胞で発現されることが確認されました（図4b）。 しかし、CaluF は穿刺細胞特異的遺伝子 Mcol1 と決して共発現されないため (図 4B) 25、したがって、軟性捕捉細胞の陽性かつ特異的なマーカーとなります。 NvSox2のノックアウトは、CaluFを発現する細胞の出現のタイミングや分布に影響を与えず（図4c）、変異型捕捉細胞が軟性細胞ではないことが確認されました。 さらに、TEMによる軟性細胞の形態の分析により、野生型動物と変異体動物の軟性細胞は形態学的に区別できないことが確認されました（図4d–i）。 これらの結果を考慮すると、NvSox2 のノックアウトにより、小さな穿孔細胞が通常指定される場所であればどこでも、小さな穿孔細胞が堅牢な罠細胞にホメオティック変換を引き起こすことが示唆されます。 対照的に、NvSox2 の喪失は、軟性捕捉細胞の発達には影響を与えず、軟性捕捉細胞と強固な捕捉細胞が異なる機構を使用してパターン化されることを示唆しています。

a 屈強な罠細胞（偽色のマゼンタ）は、野生型（N = 5）とNvSox2変異体（N = 4）の両方の動物の触手の先端に存在します。 小さな貫通細胞（青）は野生型にのみ存在し、堅牢な罠細胞（オレンジ）は変異体にのみ存在します。 色は図 2b に対応します。 a〜cでは口腔極が左側にあります。 b カルメニンF (CaluF) は、軟性捕捉細胞の特異的マーカーです。 Mcol4 (シアン) と Mcol1 (マゼンタ) は、触手と体壁で共発現されます (黒い矢印、挿入図) (N = 6 匹)。 CaluF（黄色）は触手にのみ発現します。 挿入図: CaluF は Mcol4 (白矢印) と共発現しますが、Mcol1 (マゼンタ) とは共発現しません。 c NvSox2 のノックアウトは、CaluF 発現の開始や CaluF 発現細胞の分布に影響を与えませんでした。 すべてのスケールバーは c: 50 um。 各パネルは各段階で少なくとも 10 人の個人を代表しています。 d – i 野生型（N = 3）および変異体（N = 2）の幼若ポリープからの軟性捕捉細胞のTEM。 NvSox2 のノックアウトは、鋸歯状のカプセル壁 (白い矢印) または内部移行した尿細管の側方ロッド (黒い矢印) の形態に影響を与えませんでした。 蛍光画像はフィジーを使用してコントラストと明るさを調整しました。

N. vectensis では、野生型の触手先端上皮には小さな穿刺細胞 (まれ)、大きな穿刺細胞 (豊富)、および軟性捕獲細胞 (豊富) が存在します (図 2b)。 光学顕微鏡による触手の先端の検査により、小さな穿刺細胞が体壁の効果を反映して堅牢な罠細胞に完全に変換されたことが確認されましたが、大きな穿刺細胞は野生型と変異体の両方の動物に存在します（図5a）。 大きな穿孔細胞は、触手の先端におけるこれらの細胞の分布やPaxAまたはMcol1の発現に検出可能な変化がなかったため、最初はNvSox2の喪失によって混乱していないように見えました（図2i、k）。 しかし、穿刺細胞の銛を標識するためにH2O2結合チラミドを使用すると、変異動物が異常な銛形態を示すことが示されました（図5b）。 具体的には、野生型ポリープで見られる真っ直ぐな銛と比較して、突然変異動物の大きな貫通細胞では銛の近位部分がループ状になっているように見えました。 触手先端の穿刺細胞の存在量の変化を評価するために、核の総数に対する標識銛の数を数えたところ、変異体動物では穿刺細胞が大幅に減少（〜20％）していることがわかりました（図5c）。 この結果は、触手の先端にある小さな穿刺細胞が堅牢な罠細胞に形質転換したことと一致しており（図5a）、小さな穿刺細胞が野生型動物の触手先端の穿刺細胞の約20％を構成していることを示唆しています。 異常な銛の形態をさらに調査するために、赤外線レーザーアブレーションシステム（XY Clone、ハミルトンソーン、米国）を使用して、野生型および変異型ポリープの両方で触手先端穿刺細胞の放電を誘導しました（補足ムービー1、2）。 放出された穿刺細胞の検査により、変異体のループ表現型は銛の伸長によるものであることが示唆されました（図5d、e）。 この効果を定量化するために、我々は銛の長さと、野生型および変異型ポリープの触手先端から放出された刺細胞のカプセルの長さを測定したところ、変異型では銛の長さが大幅に増加（約50％）していることが示された。動物（図5f）。

a 野生型 (N = 5) と NvSox2 変異体 (N = 4) の両方の動物の触手の先端に大きな穿孔細胞 (偽色の黄色) が存在します。 小さな貫通細胞（青）と丈夫なスピロサイト（オレンジ）も示されています。 色は図 2b に対応します。 b NvSox2 変異体の大きな穿孔細胞からの銛 (マゼンタ) は、異常な (ループ状) 形態を持っています。 核 - 白色 (DAPI)。 c NvSox2変異体の触手先端では、穿孔細胞の存在量が野生型よりも大幅に低い（Mann-Whitney U、p = 1.6E-4）。 N = 1 回の治療あたり 11 個の原発性ポリープ。 d レーザー誘発刺傷細胞放電のビデオからの静止画像 (補足ムービー S1 および S2)。 白い矢印は銛から細管への移行を示します。 赤丸部分はレーザーターゲット（発射後に移動）を示します。 e 誘導放電後の大きな貫通セル。 カプセル、モリ、細管は偽色です。 突然変異体では尿細管が完全に排出されず、不足しているように見えます。 f 突然変異動物の大きな穿刺細胞では、銛が野生型よりも有意に長い（Mann-Whitney U、p = 2.1E-13）。 分析した細胞の数: N = 57 (野生型)、N = 41 (変異体)。 g ループ状の銛の形態 (白い矢じり) は、イソギンチャク Cylista elegans の大塩基性マスチゴフォアに存在します (N = 2 個体)。 同じ種の微塩基性マスチゴフォアも示されています。 h N. vectensis の腸間膜における微小塩基性マスチゴフォア (貫通細胞) の形態は、NvSox2 のノックアウトによる影響を受けませんでした (各 N = 6 匹)。 銛 (白い矢じり) には b のようにラベルが付けられます。 i 大きな穿孔細胞における銛形態形成の駆動における NvSox2 の役割の図。 NvSox2 のノックアウトは、この細胞系統における PaxA または Mcol1 の発現には影響しませんが、銛の長さは増加します (マゼンタのボックス)。 細長い銛は、カプセル内に収まるように輪にする必要があります。 すべてのボックス プロット: 中央値 - 中央線、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル - ボックス、5 パーセンタイルと 95 パーセンタイル - ひげ、外れ値 - 個々の点。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 蛍光画像はフィジーを使用してコントラストと明るさを調整しました。

NvSox2 変異体の触手の先端にある大きな穿刺細胞のループ状の銛は、イソギンチャクの他の種に見られる穿刺細胞の一種である大塩基性マスチゴフォアの銛のループ状の外観を表現型模写しています。 大基本の貫通セルでは、銛はそれが入っているカプセルよりも長いため、銛はカプセルの内側に収まるようにループする必要があります。 この状態は、イソギンチャク Cylista elegans からの大塩基性マスチゴフォアによって示されています (図 5g)。 対照的に、微生物細胞はカプセルの長さよりも短い銛を発達させるため、銛はループすることなくカプセルの内側に完全に収まります。 N. vectensis では、すべてのマスチゴフォアは微塩基性であり、消化管の外胚葉上皮にのみ存在します (図 2b)。 NvSox2のノックアウトは、すべてのマスチゴフォアが野生型動物と変異動物の両方で微基本的形態を保持しているため、N. vectensisのマスチゴフォア銛のサイズに影響を与えませんでした（図5h）。 銛の伸長の駆動における NvSox2 の役割は、N. vectensis の大きな穿刺細胞 (基底性イソリザス) に限定されているように見えますが、銛の発達のこの単一遺伝子制御 (図 5I) は、大塩基性細胞の成長を制御するメカニズムを提供します。銛の状態は、他の種類の刺細胞において独立して何度も進化した可能性があります 35。

Sox 遺伝子は動物ゲノム中に遍在しており、8 つの主要なグループ (SoxA ～ SoxH) に分類されています19。そのうちの少なくとも 4 つは刺胞動物と脊椎動物の共通の祖先に存在した可能性があります (SoxB、SoxC、SoxE、SoxF)。 N. vectensis 由来の Sox 遺伝子のこれまでの系統解析では、NvSox2 が刺胞動物特異的オルソログ 20 または SoxB クレードのメンバーであることが示唆されています 24、36、37。 これらの仮説をさらに検証するために、15 匹の刺胞動物と 6 匹の左右相称動物からの Sox 遺伝子の最尤系統系統図を構築しました (補足図 5; 補足データ 1)。 この広範な分類群のサンプリングにより、サンゴやイソギンチャクの NvSox2 オルソログを含むクレードの単系統については強い裏付けが得られましたが、NvSox2 クレードと既知の左右相称 Sox 遺伝子との関連性については弱い裏付けが見つかりました。 さらに、髄生動物、八サンゴ類、またはケリアントス科のイソギンチャク（チューブイソギンチャク）では NvSox2 のオルソログの証拠は見つからず、NvSox2 が、捕獲細胞（スピロサイト）の起源の後、サンゴとイソギンチャク（非ケリアントス科の六方サンゴ類）の茎の祖先で生じたことを示唆しています。 ）（図1m）。

小さい穿刺細胞と大きい穿刺細胞は、同じ細胞型の 2 つのサイズ クラスであると考えられてきましたが 25、これらが実際には分子的に異なる 2 つのタイプの穿刺細胞であることを示します。 NvSox2の非存在下では、小さな穿孔細胞は新しい（罠にかかる）アイデンティティを獲得しました（図6a）が、NvSox2の喪失は大きな穿孔細胞の細胞のアイデンティティを変化させるには不十分でした。 したがって、NvSox2は、小さな穿刺細胞（例、基底棘や頂端皮弁を備えた厚い被膜）の穿刺表現型に関連する一連の形質の発達に必要ですが（図3）、大きな穿刺細胞では単一の形質（銛の長さ）のみが必要です。細胞を貫通します（図5）。 進化的には、NvSox2が強力な罠細胞系譜に組み込まれることで、貫通細胞表現型の並行起源が可能になったようです（図6b）。 重要なことに、このことは、穿孔細胞（「刺細胞」）と捕捉細胞（「スピロサイト」）がかつて考えられていたほど系統発生的に異なっておらず、代わりに単一の遺伝子によって制御される2つの代替刺細胞運命を表していることを示唆している。

NvSox2 は小さな貫通細胞 (刺胞細胞、青色) の指定に必要です。 捕捉細胞 (スピロサイト、マゼンタ) は、NvSox2 の非存在下で指定されます。 b 厚いカプセル壁、頂端のフラップ、とげのある銛、および尿細管を備えた穿孔細胞を生成するために、カプセルおよび可逆尿細管を備えた祖先の捕捉細胞の進化的選択のシナリオ。 c Edwardsiella 属のイソギンチャクは、さまざまな生息地への適応中に貫通細胞と罠細胞の間の移行を促進する際の NvSox2 の役割の可能性を示しています。 E. ignota と E. andrillae は姉妹分類群です。 E. ignota は砂/泥に穴を掘って体壁に貫通細胞を持ち、E. andrillae は海氷に穴を掘って体壁に捕捉細胞を持っています。 E. lineata と E. carnea は両方とも、自由生活状態 (砂/泥に穴を掘る) と触手を持たない寄生状態の間で移行します。 この変化は、刺傷細胞の種類間の移行によって反映されます。 イソギンチャクのイラストは以下から変更されました: Babonis、LS & Martindale、MQ PaxA は、イソギンチャク Nematostella vectensis の刺胞細胞の発達に必要ですが、PaxC ではありません。 EvoDevo 8、14 (2017) —CC BY 4.0。 d 単一遺伝子のホメオシスは、異なる生息地に生息する近縁の刺胞動物の体壁で観察される刺胞タイプの広範かつ不連続な変動の機構的な説明を提供する。 捕獲細胞 (マゼンタのボックス) はハードサンゴ、イソギンチャク、チューブイソギンチャクのいたるところに見られ、おそらくこのクレードの最後の共通祖先で発生したと考えられます。 チューブイソギンチャクには NvSox2 のオルソログが欠如しており、この遺伝子がハードサンゴやイソギンチャクの茎の祖先に生じたことを示唆しています。 一部のイソギンチャク（例：N. vectensis および E. ignota）の体壁における祖先の罠細胞の発生を促進する遺伝子制御ネットワークへの NvSox2 の組み込みは、これらの分類群が体壁に貫通細胞（バシリッチ、青いボックス）を持つようになった理由を説明します。一方、それらの近縁種（例えば、それぞれ変異体 N. vectensis と E. andrillae）は、代わりに罠細胞を持っています。 細胞アイデンティティの単一遺伝子制御も同様に、このクレード全体の刺傷多様性のホメオティック移行を促進する可能性があります。 WT野生型。

細胞の同一性のホメオティックな変換は、2 つの密接に関連した刺胞動物に見られる刺胞の補体がどのようにして非常に劇的に異なるかを説明します。 穴を掘るイソギンチャクはさまざまな生息地で見られ、この現象の貴重な実例を提供します (図 6c)。 一部の種は砂地の生息地で見られますが（Nematostella vectensis や Edwardsiella ignota など）、他の種は海氷に穴を掘ります（Edwardsiella andrillae など）38。 E. アンドリラエの体壁に見られる強力な罠細胞から、E. イグノタの体壁に見られる小さな貫通細胞への進化的移行は、体の発達を促進する遺伝子制御ネットワークへの NvSox2 オーソログの組み込みによって説明できる可能性があります。 E. ignota には壁刺細胞が存在するが、E. andrillae には存在しない。 同様に、姉妹種の E. lineata と E. carnea は両方とも、一生の間に自由生活状態 (砂/泥の中に穴を掘る) から寄生状態 (有櫛動物の消化管に穴を掘る) へ生態学的移行を経験します 39。この移行には、これら 2 つの異なるライフステージにおける体壁の刺細胞タイプの変換が伴います。 貫通細胞は自由生活個体の体壁に見られます。 寄生段階におけるこれらの動物の体壁の刺細胞の具体的な正体については議論されているが 40,41 、それらは我々の NvSox2 変異体で同定された強力な罠細胞と形態的に非常によく似ている。 これは、同様の単細胞ホメオティック現象が、各生活段階で使用されるさまざまな生息地に関連する刺細胞のアイデンティティの変化を調節している可能性があることを示唆しています。 このシナリオはまた、独特の生息地に侵入する他の穴掘りイソギンチャクの体壁に見られる異なる刺細胞タイプ間の多数の遷移を説明する可能性があり、刺胞動物全体の密接に関連した種の間で見られる刺細胞タイプの不連続な変動の説明を提供します（図6d） )40,41。

我々は、単一の転写因子（NvSox2）のノックアウトにより、貫通細胞が捕捉細胞の形態（図3）および分子特徴（図2および4）を帯びること、およびこれらの変異細胞が放電能力を保持していることを示した。 まとめると、これらの結果は、この突然変異が機能的に関連しており、したがって、真のホメオティック変換であることを裏付けています7。 重要なのは、この形質転換により、Nematostella vectensis を生み出した系統の祖先で失われた一種の罠細胞が回復したことです。 このように、我々はホメオシスの特殊なケース、つまり単細胞隔世遺伝、つまり現生種における祖先細胞型の回復を示しました。 これは刺胞動物における隔世遺伝の最初の証拠であるため、我々の結果は、細胞運命のホメオティック制御が、刺胞動物と左右相称動物の最後の共通祖先である8億年以上前から生物多様性の拡大に貢献してきた古代の機構であることを示唆している42。

単一の遺伝子を操作することによって祖先細胞型を復活させる私たちの能力は、ホメオシスが発生の柔軟性と環境選択圧力をどのように結び付けて、新しい細胞型の出現を促進するかを示しています。 具体的には、祖先細胞型の機能的特性を沈黙させながら、その仕様に関する指示を維持できる能力により、動物は新しい生息地を探索しながら極めて柔軟に行動できるようになります。 この考えのさらなる裏付けとして、単一の調節遺伝子が蝶の羽の色パターンのホメオティックシフトを制御することが判明し、多細胞表現型が単一の遺伝子スイッチによって制御される場合に急速な形態進化が起こり得る機構が提供される43。 これらの例は、単一の遺伝子を使用して複数の考えられる細胞同一性の中から選択する能力が、局所条件への適応のための効率的な機会をどのように生み出すことができるかを示しています。 したがって、サイレント化された細胞型を再展開する能力は、動物において細胞型の多様性を生み出すための、広く普及しているが過小評価されているマクロ進化のメカニズムである可能性がある。

NvSox2 が大きな穿刺細胞における銛の形態形成を制御する (仕様ではなく) という観察は、刺細胞の別の系統 (マスティゴフォア、図 5) で観察された表現型の変動を再現しています。 NvSox2 が大きな穿刺細胞の銛の長さのみを制御するという事実は、棘の形態、とげの数、嚢壁の構成、および銛の形状を同様に制御する個々の遺伝子を見つけることが可能であることを示唆しています。頂端構造。 実際、N. vectensis の穿孔細胞機能に関する最近の研究では、スピナリン様タンパク質 44 が銛の特定の成分であることが特定されました 45。 NvSox2 などの転写因子とスピナリン様などの銛形態を駆動するエフェクター遺伝子の調節関係を単細胞ベースで調査する今後の研究は、個々の刺細胞タイプの進化的多様性を再構築し、遺伝子制御ネットワークがどのように進化するかについてのより深い理解。 線虫から説明された神経アイデンティティのモジュール制御と同様に46、このフレームワークは、進化が細胞内表現型の微細な側面を制御する遺伝子をどのように組み合わせて、動物の生物多様性を推進する多様な細胞型を生み出すことができるかを説明し、進化を特徴付けるモデルを提供する他の新しい細胞小器官の。

NvSox2 遺伝子座は、公開されている 2 つの CRISPR/Cas9 プロトコルの修正を使用して削除されました 47,48。 簡単に言うと、NvSox2遺伝子座の異なる部位を標的とするように5つのガイドRNAが設計され、そのうち4つはコード配列に、1つは5' UTRにありました（補足図1、表1）。 ガイドRNAはSynthego（米国）から購入し、製造業者の指示に従ってヌクレアーゼフリー水（Synthego）中で30μMに再構成した。 Cas9 タンパク質 (PNABio CP01-50) を、製造業者の指示に従って、ヌクレアーゼフリー水 (Ambion AM9937) 中で 1 mg/ml に再構成しました。 ガイド RNA を gRNA:Cas9 の比率 5:4 (体積:体積) で Cas9 と混合し、室温で 10 分間インキュベートし、0.2 mg/ml Alexa-555 RNAse フリー デキストラン (Invitrogen D34679) とともに接合子に注入しました。ヌクレアーゼフリーの水（Ambion）。 ガイド RNA または Cas9 の非特異的効果があるかどうかを確認するために、対照胚にガイド RNA を注入したが Cas9 タンパク質を注入しないか、または Cas9 タンパク質のみを注入しました。 これらの動物は正常に発育したため、それ以上の検査は行われませんでした。 モザイク F0 NvSox2 変異体胚を 16℃ で生殖成熟まで育て、産卵して F1 世代を生成しました。 F1 ポリープの触手先端からゲノム DNA を抽出し、配列を決定して変異をチェックしました。 1人のF1女性と1人のF1男性がNvSox2遺伝子座に重大な欠失を有することが特定され（補足図1）、F2世代の作製に使用されました。 さらなる細胞/組織分析はすべて F2 世代で実施されました。

刺細胞の発生に対する NvSox2 ノックアウトの効果をアッセイするために、正常ヤギ血清 (Sigma G9023) で 1/1000 に希釈したミニコラーゲン 4 (α-Mcol4) に対する抗体 25,26 を用いて、未熟刺細胞を 4℃ で一晩標識しました (補足図4）および成熟刺細胞（穿孔細胞のみ）を、高濃度DAPI（0.1％Tweenおよび10mM EDTAを含むPBS中143μM）中で25℃で30分間標識した25、26、49。 NvSox2、PaxA、Mcol1、および CaluF の胚発現は、確立されたプロトコールに従って in situ ハイブリダイゼーション (ISH) を使用して検査されました 50,51。 2 色蛍光 ISH を実現するために、サンプルをジゴキシゲニン標識とフルオレセイン標識 mRNA プローブの両方で同時に 63℃ で一晩インキュベートしました。その後、抗 DIG/POD 抗体および抗 FL/POD 抗体を使用してプローブを連続的に検出しました (Roche 11207733910、11426346910) ) およびフルオレセインまたは Cy3 結合チラミド。

発育中の動物を、触手芽の段階（16℃で受精後240時間）で検査のために固定した。 Mcol1 mRNA と Mcol4 タンパク質を共局在させるために、同じ組織で蛍光 ISH とそれに続く免疫組織化学を実行しました 26。 次に、標識組織をスライドガラス上のグリセロールにマウントし、Zeiss 710 共焦点顕微鏡で画像化し、Imaris ソフトウェア v 7.6.1 (Oxford Instruments, USA) を使用して Z スタックを 3D 画像にレンダリングしました。 Imaris の Crop ツールを使用して対象領域の境界を設定し、触手芽の外側の 100 × 100 μm 正方形の対象領域内で標識細胞を目で数えました。 両側マン・ホイットニー U 検定を使用して、野生型と NvSox2 変異体の α-Mcol4 で標識された細胞の数を比較したところ、α-Mcol4 で標識された細胞の総数に有意差は見つかりませんでした (p = 0.623176)。 次に、同じ関心領域内の Mcol1 と Mcol4 を共発現する細胞の数を数えたところ、野生型動物と比較して NvSox2 変異体が大幅に減少していることがわかりました (p = 1.57E-4)。 データは、α-Mcol4抗体で標識され、Mcol1 mRNAプローブでも標識された細胞のパーセントとして示されている(図2l)。 N = 10 匹の触手芽期動物を各処理で検査しました。

NvSox2 が刺細胞遺伝子制御ネットワークの一部であるかどうかを判断するために、以前に検証されているモルフォリノ (GeneTools, LLC) を使用して SoxB2 と PaxA をノックダウンしました 22,26 (配列は表 1 に提供)。 モルフォリノは、製造業者の指示に従って、ヌクレアーゼフリー水（Ambion）中で1 mMに再構成され、使用日まで暗所に保管された。 注射当日、モルホリノ（MO）を65℃で10分間加熱し、25℃で1分間遠心分離し、蛍光デキストランを含むヌクレアーゼフリー水で0.9mMに希釈し、最終濃度0.2mg/mlとした。 qPCR 分析では、異なる日に実行された 3 回の独立した注射を表す各条件 (野生型/未注射、コントロール MO、SoxB2 MO、および PaxA MO) の 3 つの反復を、デルタデルタ CT 法と R 統計の PCR パッケージを使用して比較しました。コンピューティング環境52,53。 qPCR 解析の発現値は、未注入胚における 1.0 に正規化されたハウスキーピング遺伝子伸長因子 1β (EF1β) の発現に対する変化倍数として表示され、統計的有意性は SoxB2 MO 注入胚と PaxA MO 注入胚の比較から計算されました。 MO注入胚を制御するため。

変異細胞のサイズと存在量は、条件ごとに N = 12 ポリープ (野生型および NvSox2 変異体) でスカッシュプレップによって解離した一次ポリープ (4 触手段階) で測定されました。 各ポリープを 7.14% MgCl2 で固定化し、0.1% Tween (PTw) を含む PBS 中の 4% パラホルムアルデヒドで 4℃ で 2 時間固定し、PTw で十分に洗浄し、スライドガラス上の最小量のグリセロールに個別にマウントしました。 カバーガラスを固定組織の上に下げ、押しつぶす／塗抹して固定されたポリープを解離させた。 変異細胞数は、解離した組織を通る 3 つの重複しない視覚横断面で同時に計数された貫通細胞の数に対する変異細胞の数として表示されます。 細胞サイズは、Fiji v 1.53 f (ImageJ)9 の Measure ツールを使用して、これらのトランセクトに沿ってキャプチャされた重複しない画像で評価されました。

Cy3 結合チラミドを使用して銛 (穿孔細胞の可逆尿細管の基底棘部分) を標識する方法がこの研究のために開発されました。 一次ポリープを、０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＴｗ中４％パラホルムアルデヒド中で２５℃で１分間固定し、ＰＴｗ中４％パラホルムアルデヒド中で４℃で１時間固定した。 固定組織をヌクレアーゼフリー水で２回洗浄してＰＴｗを除去し、使用するまで−２０℃で１００％メタノール中で保存した。 染色のために、組織をメタノールから PTw にゆっくりと再水和し、25℃で PTx (0.2% Triton を含む PBS) で 3 回 (各 20 分)、3% H2O2 で 3 回 (各 20 分) 洗浄しました。その後、組織を洗浄しました。 PTw中で3回(各10分)、過剰なH2O2を除去し、0.2%チラミド-Cy3(0.001%H2O2を含む)中で暗​​所で45分間インキュベートした。 過剰なチラミドと H2O2 を PTw で 3 回洗浄して除去し、ポリープを 1uM DAPI で 30 分間対比染色した後、グリセロール中のスライドガラスにマウントし、粘土の足で安定させたカバーガラスの下でわずかに圧縮しました。 イメージングは​​、Zeiss 710 共焦点で標識と同じ日に実行されました。 Imaris を使用して Z スタックを 3D 画像にレンダリングし、トリミング ツールを使用して対象領域の境界を設定しました。 条件ごとに N = 11 個のポリープ (野生型または変異体) からの標識されたモリを目で数え、スポット ツールを使用して核を自動的に数えました。 銛のサイズとカプセルのサイズは、フィジーの測定ツールを使用して、刺細胞のレーザー誘発放電後に捕捉された触手先端の重複しない画像で測定されました54。

刺細胞の排出を誘導するために、幼若ポリープ (6 触手段階) を 7.14% MgCl2 中で 5 分間固定し、スライドガラスに載せ、粘土の足で安定させたカバーガラスの下でわずかに圧縮しました。 Zeiss Axiscope の 20 倍対物レンズに取り付けられた赤外線レーザー アブレーション システム (XY Clone、Hamilton Thorne) を使用して、100% 出力および 500us パルスで触手先端刺細胞からの放電を誘発しました。

分析を開始する前に、実験が計画され、Phylotocol55 に記載されました。 その後の分析の修正は、その文書で指摘され、正当化されました。 Sox 遺伝子以外の多くの遺伝子には HMG ボックスが含まれるため、HMG 隠れマルコフ モデル (HMM) だけを使用して Sox 遺伝子を検索すると、多くの非ターゲット配列が生成されます。 Sox 遺伝子を具体的に同定するために、hmmbuild (hmmer.org) を使用してアウトグループ配列 (Tcf/Lef および Capicua/CIC) を除去した後、公開されている Sox 遺伝子アラインメント 56 からカスタム HMG HMM を生成しました。 次に、このカスタム HMM を使用して、15 匹の刺胞動物と 6 匹の左右対称動物から翻訳されたトランスクリプトーム内の Sox 遺伝子を検索しました。 使用した刺胞動物分類群の略語は次のとおりです。Aala — Alatina alata、Adig — Acropora digitifera、Amil — Acropora millepora、Epal — Exaiptasia pallida、Avan — Atolla vanhoeffeni、Ccrux — Calvadosia cruxmelitensis、Came — Ceriantheopsis americana、Chem — Clytia hemisphaerica、Cxam - Cassiopea xamachana、Elin - Edwardsiella lineata、Hech - Hydractinia echinata、Hmag - Hydra magnipapillata、Hsan - Haliclystus sanjuanensis、Nvec - Nematostella vectensis、Rren - Renilla reniformis。 左右相称者用：Bflo - Branchiostoma floridae、Cint - Ciona intestinalis、Cele - Caenorhabditis elegans、Dmel - キイロショウジョウバエ、Hsap - ホモサピエンス、Lgig - Lottia gigantea、Spur - Strongylocentrotus purpuratus。 このカスタム HMM を hmm2aln スクリプト (https://github.com/josephryan57) と組み合わせて使用​​し、HMM の生成に使用された元のシーケンスを含むアライメントを生成しました。 次に、このアライメントからすべての有櫛動物、海綿動物、板生動物のシーケンスを削除し、ツリーを生成しました。

系統解析は、公開されたプロトコールに従って実行されました58。 簡単に言うと、IQ-TREE のモデル ファインダー機能を使用して、アライメントに最適な代替モデルを特定しました (補足データ 1 として提供)。 次に、25 個の最大節約開始ツリーを使用した RAxML、25 個のランダム開始ツリーを使用した RAxML、および IQ-TREE を使用したデフォルトの実行を使用して、3 つの最尤解析を並行して実行しました。 次に、3 つの分析すべての出力からの最尤値を比較して最適なツリーを選択し、分岐サポートに RAxML を使用して 1000 回の高速ブートストラップを実行しました。 最終的なツリー ファイルは、プレゼンテーション用に FigTree v1.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) および Adob​​e Illustrator v 24.1.1 で変更されました。

カウントデータのペアごとの比較（図2j、l、図3n、および図5c、f）は、Microsoft Excel v 2122の両側マンホイットニーU検定を使用して分析されました。 捕捉細胞サイズの形態計測分析（図5） . 3l–n) は、ANCOVA または Bonferroni ポストホック分析を備えた ANOVA を使用して実行され、qPCR データはデルタデルタ CT 法と R (v 4.2.1) の PCR パッケージを使用して分析されました52,53。 野生型動物の成熟刺細胞の電子顕微鏡写真（図1、図3c〜f）は、少なくとも2人の個体からサンプリングされた、指定された種類の少なくとも3つの細胞（線状細胞、スピロサイト、または鱗球）の代表的な画像です。 NvSox2 変異体の電子顕微鏡写真（図 3g–k）は、2 人の個体からの少なくとも 2 つの細胞の代表的な画像です。 各個体から画像化された細胞の正確な数: 図 3g (N = 6,15)、図 3h (N = 12,15)、図 3i (N = 2,2)、図 3j (N = 5、 7)、図3k (N = 4,5)、図4g (N = 9,10)、図4h (N = 5,7)、図4i (N = 7,8)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソースデータを含む、この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文（およびその補足情報ファイル）に含まれています。 トランスジェニック動物は、材料譲渡契約の完了を待って、責任著者へのリクエストにより利用可能になります。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

カスタム スクリプト (hmm2aln) を使用して系統解析用に HMM を調整しました。 このスクリプトは https://github.com/josephryan57 から入手できます。

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電子顕微鏡検査は、ハワイ大学マノア校の生物電子顕微鏡施設 (BEMF)、電子顕微鏡分析センター (CEMAS)、キャンパス顕微鏡画像施設 (CMIF)、OSU 総合大学で実施されました。オハイオ州立大学 (OSU) のがんセンター (OSUCCC) 顕微鏡共有リソース (MSR)。 OSU の TEM のサンプル準備を支援してくれた Jeffrey Tonniges に感謝します。 資金提供：この研究は、米国航空宇宙局から MQM への資金提供 (#NNX14AG70G)、米国科学財団から JFR への資金提供 (#1542597)、OSU とコーネル大学からそれぞれ MD と LSB への機関研究資金によって支援されました。

ホイットニー海洋生物科学研究所、フロリダ大学、セントオーガスティン、フロリダ州、米国

レスリー・S・バボニス、カミーユ・アンジョルラス、ブレント・M・フォスター、フレドリック・ヒューゴソン、ジョセフ・F・ライアン、マーク・Q・マーティンデール

米国ニューヨーク州イサカのコーネル大学生態学および進化生物学部

レスリー・S・バボニス

米国ワシントン DC、NOAA 漁業、科学技術局、国立系統研究所

アビゲイル・J・レフト

スミソニアン国立自然史博物館、無脊椎動物部門、ワシントン DC、米国

アビゲイル・J・レフト

フロリダ大学生物学部、ゲインズビル、フロリダ州、米国

ジョセフ・F・ライアン＆マーク・Q・マーティンデール

オハイオ州立大学、進化、生態学、および生物生物学部、米国オハイオ州コロンバス

メアリー・ミーガン・デイリー

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LSB、CE、BMF、FH、および MQM は、CRISPR 試薬の開発、マイクロインジェクション、ISH、クローニングおよび配列分析、共焦点顕微鏡検査などの実験室手順を実行しました。 LSB、AJR、MD は電子顕微鏡検査を実施し、変異細胞の表現型を分析しました。 LSB と JFR は系統解析を実施しました。 LSB はこの研究を考案し、原稿を書きました。 著者全員が原稿を編集し、最終草案を承認しました。

レスリー・S・バボニスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Babonis、LS、Enjolras、C.、Reft、AJ 他。 単細胞隔世遺伝は、イソギンチャクにおける細胞型の多様化の古代のメカニズムを明らかにします。 Nat Commun 14、885 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36615-9

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受信日: 2022 年 2 月 28 日

受理日: 2023 年 2 月 9 日

公開日: 2023 年 2 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36615-9

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